摘要(ABSTRACT)

众所周知，一些肠道细菌，如大肠杆菌（Escherichiacoli），能产生大量的分子氢（H₂）。虽然H₂的抗氧化作用已有充分记载，但本研究探讨了肠道定植菌释放的H₂是否会影响刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠肝炎。全身性抗生素处理显著降低了肝脏和肠道中的H₂水平，并抑制了肠道细菌。通过测定血清中的AST、ALT、TNF-α和IFN-γ水平发现，抗生素抑制肠道菌群加重了ConA诱导的肝炎，而用产H₂的大肠杆菌重建肠道菌群（而非H₂缺陷型突变大肠杆菌）则下调了ConA诱导的肝脏炎症。此外，体外实验表明，ConA刺激的脾淋巴细胞产生的TNF-α和IFN-γ均可被引入H₂显著抑制。这些结果表明，肠道细菌释放的H₂可以抑制ConA在肝脏中诱导的炎症。

引言(Introduction)

分子氢（H₂）溶于水的抗氧化作用在缺血再灌注诱导的小鼠脑损伤模型中得到了证实。随后的几项研究也表明，H₂可以抑制由缺血再灌注后氧化应激引起的器官（如肝脏、肠道和心脏）组织损伤。由于炎症与氧化应激之间的联系（彼此激活）已被充分认识，一种高效的抗氧化剂也应能抑制组织破坏性疾病中诱导的炎症。然而，关于H₂抗炎方面的报道很少见。

重要的是，在以往使用动物模型的研究中，H₂是以气体形式或溶于水后外源性施用于动物。但是，同样不可否认的是，一些肠道细菌，如大肠杆菌（E.coli），因其拥有氢化酶而能够产生H₂。如果肠道细菌确实会释放H₂，那么这种内部产生的H₂应该会影响宿主对氧化应激和炎症应激的抵抗力。然而，迄今为止，尚无研究探讨肠道细菌产生的H₂对宿主抵抗炎症刺激的影响。

刀豆蛋白A（ConcanavalinA,ConA）是一种凝集素，能凝集血液红细胞，也是一种主要刺激T细胞的促分裂素。因此，它通过活化的淋巴细胞浸润引起急性炎症，导致肝细胞大量坏死性组织损伤并伴有肝窦内充血。因此，ConA诱导的肝炎已被用作一种实验性小鼠模型，其反映了人类自身免疫性肝炎的大部分致病特性。无胸腺裸鼠和SCID小鼠对ConA诱导的肝炎具有抵抗力，这清楚地证明了T细胞在诱导ConA介导的肝损伤中的允许作用。尽管ConA造成的组织损伤仅限于肝脏，但这种器官特异性的潜在机制仍不清楚。然而，ConA介导的T细胞活化也会增加血液中促炎细胞因子的水平，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ），它们由活化的T细胞释放，并被认为在ConA诱导的肝脏炎症的发展中起关键作用。

本研究利用刀豆蛋白A诱导的急性肝炎小鼠模型，探讨了(1)肠道定植菌释放的H₂量以及(2)肠道细菌释放的H₂对肝脏诱导的炎症的影响。

材料与方法(Materialsandmethods)

动物(Animals)

使用C57BL/6j小鼠（8-10周龄雄性），饲养于恒温的常规房间中，保持12小时光暗周期。本研究采用的实验程序得到了ForsythIACUC的批准。

建立表达GFP的大肠杆菌(EstablishmentofGFP-expressingE.coli)

本研究使用大肠杆菌菌株W3110（ATCC27325）及其HypF基因缺失突变株PMD23（该菌株不产生H₂）（补充材料1；可在线获取）。HypF对于活性氢化酶的合成是必不可少的，因为缺少它会导致氢化酶活性降低>95%。通过电穿孔，两种大肠杆菌菌株均用pGFPuv载体（Clontech,MountainView,CA）转染，该载体在启动子中含有氨苄青霉素抗性基因（Ampʳ）。所得的两株菌为：大肠杆菌W3110gfp⁺（Ampʳ⁺/GFP⁺/HypF⁺）和大肠杆菌PMD23gfp⁺（Ampʳ⁺/GFP⁺/HypF⁻）。它们在含有氨苄青霉素（100µg/ml）的LB肉汤中培养。

分子氢的测量(Measurementofmolecularhydrogen)

使用针型氢传感器（UnisenseA/S,Aarhus,Denmark）测量小鼠器官中产生的分子氢（H₂），方法遵循Hayashida等人发表的方法。小鼠在CO₂吸入麻醉下处死后，立即将针型氢传感器放入用25G针头在器官中预先制备的引导路径中。或者，将氢传感器直接放入通过心脏穿刺采集的血液中。H₂的标准阳性浓度是在大气压下将H₂气体饱和于水中制备（25°C时为781µM或37°C时为721µM），而未处理的对照水则用于表示H₂量为0µM。始终考虑H₂的扩散因子并进行调整（例如，塑料管中采血样本的扩散速率为0.7µM/min）。

制备H₂水溶液(GenerationofH₂dissolvedwater)

将高纯度H₂气体（Airgas,Salem,NH）注入水或培养基中，直至H₂浓度达到饱和（25°C时为780µM）。然后，通过稀释制备适当浓度的H₂溶液。饱和H₂水溶液的pH值为7.6，氧化还原电位（ORP）非常高（-511mV）。

刀豆蛋白A诱导的急性肝炎模型(ConcanavalinA-inducedacutehepatitismodel)

实验方案A(ExperimentalProtocol-A):(1)小鼠自由饮用含有抗生素混合物（磺胺甲恶唑，8mg/ml和甲氧苄啶，1.6mg/ml）的水或对照无抗生素水，持续3天。(2)随后两天，两组动物均自由饮用无抗生素水进行休养。(3)向两组小鼠静脉注射ConA（Sigma,St.Louis,MO,15mg/kg；生理盐水溶液），并在注射后0、2和10小时监测血清中的ALT和AST水平。

实验方案B(ExperimentalProtocol-B):(1)小鼠自由饮用含有抗生素混合物（磺胺甲恶唑，4mg/ml；甲氧苄啶，0.8mg/ml；和氨苄青霉素，0.1mg/ml）的水，持续3天。(2)随后三天，动物继续自由饮用含有氨苄青霉素（0.1mg/ml）的水。(3)向两组小鼠注射ConA（15mg/kg，生理盐水溶液）：(a)一组在注射前12小时以及注射后0小时和3小时灌胃给予H₂富集水（780µM,pH7.6,1ml/只，n=5/组）；(b)另一组给予对照水（1ml/只，n=5/组）。ConA注射后，两组小鼠仍供应含有氨苄青霉素的饮用水。实验方案B的示意图见图2A。

实验方案C(ExperimentalProtocol-C):(1)小鼠自由饮用与方案B相同的三种抗生素混合物水，持续3天。(2)随后三天，动物自由饮用含有氨苄青霉素（1mg/ml）的水。(3)向两组小鼠注射ConA（15mg/kg，生理盐水溶液）：(a)一组用大肠杆菌W3110gfp⁺重建菌群（n=5/组）；(b)另一组用大肠杆菌PMD23gfp⁺定植（n=5/组）。将在对数生长期中期的两株大肠杆菌收集起来，在ConA注射前2天，使用Popper灌胃针灌胃给予小鼠（10⁹细菌/100µl含5%羧甲基纤维素的生理盐水/只）。ConA注射后，两组小鼠仍供应含有氨苄青霉素的饮用水。实验方案C的示意图见图3A。

肝脏炎症生物标志物和促炎细胞因子的测量(Measurementofliverinflammationbiomarkersandproinflammatorycytokines)

通过检测试剂盒并按照制造商的说明（BiotronDiagnostics,Hemet,CA）测定血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平来分析肝损伤程度。促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的定量使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（PeproTech,RockyHill,NJ）进行。