用失明小鼠的视网膜进行体外验证。

图6、用视网膜外植体进行体内评估。

接下来，我们测试了PDMS光伏界面在刺激RGC(视网膜神经节细胞)方面的体内外功效。为此，我们使用了视网膜变性小鼠模型，该模型被公认为是视网膜色素变性的绝佳模型。为了尽可能避免存活光感受器的自然反应，我们从老龄小鼠的视网膜上采集了假体诱发的RGCs尖峰活动的胞外记录。视网膜被分层覆盖在PDMS-光伏界面中央5毫米的区域上，模拟视网膜外结构(图6a)。根据PC密度测定结果，我们只测试了10ms脉冲(PC响应峰值)，辐照度范围很广(从47.35到29.07μW mm-2)。光脉冲在记录的RGC中诱发了假体诱发的尖峰活动(图6b)。尖峰用阈值算法检测(图6b)，转换成光栅图，并显示为刺激周时间直方图。正如之前所报道的，我们观察到了三种类型的反应，分别为短潜伏期、中潜伏期和长潜伏期(SL、ML和LL)。SL尖峰的出现(在光开始后10ms内诱发，1个分区)表明RGC受到了直接的电刺激；而ML和LL尖峰的出现则表明网络介导的激活。我们发现，从测试的第一个辐照度(47.35μW mm-2)开始就能诱发SL尖峰，然后发射率缓慢上升，并在1.08mW mm-2以上保持稳定，直到测试的最高辐照度(图6c)。然而，第一个辐照度下的平均潜伏期(图6d)相对较长(6.05±0.23ms)；随着辐照度的增加，潜伏期逐渐缩短，当辐照度高于1.08mW mm-2时，潜伏期稳定在4.12±0.07ms(图6d)。在此范围内(高于1.08)，辐照度的平均抖动为0.39±0.05ms。这表明，在辐照度高于1.08mW mm-2时，SL响应达到饱和，这与PC密度的测量结果相符。当辐照度低于1.08mW/mm2时，平均延迟时间似乎更短，但抖动变化更大，表明响应更不稳定(图6d)。ML(图6e)和LL(图6f)尖峰的发射率逐渐增加，但在1.08mW mm-2之后也变得稳定。作为对照，当视网膜分层在裸露的PDMS基底面上时，在所有测试的辐照度下均未检测到光诱发反应。正如其他人已经证明的那样，我们还在第二个细胞亚群中验证了使用突触阻断剂可以取消ML和LL尖峰的人工激活。这证实了ML和LL是由内部视网膜回路激活诱发的假设。

空间选择性。

图7、假体刺激的空间限制。

然后，我们采用实验/计算混合方法来解决空间选择性问题。首先，我们使用玻璃微电极(图7a、b)测量了单个像素被照亮时三个方向(D1、D2和D3)的径向电压扩散(图7c)。对于每个被照亮的像素，三个主要方向上的归一化电压扩散都已取平均值。所有测试像素的平均电压分布已绘制并用高斯函数插值(图7d)。实验数据与有限元分析(FEA)模型获得的归一化电压分布图相吻合(图7d，蓝色虚线)。模拟曲线的半最大值全宽(FWHM)(图7d，灰色虚线)被视为有效活化面积，约为100微米。有限元分析模拟用于描述照明诱导的直径不断增大的归一化电压曲线(图7e)。光斑尺寸从1像素增加到7像素和19像素会增加电位。最后，我们模拟了不同激活模式的影响(图7f)。在所有情况下，都显示了与光照模式相对应的空间选择性电位曲线。

细胞毒性和长期功能。

图8、视网膜假体的使用寿命。

为了验证POLYRETINA的长期功能，我们测试了半球形的机械影响。为此，我们在圆球形的PDMS支架上粘接了PDMS光伏界面。粘合过程会在PDMS光伏界面上产生拉伸应力，导致聚合物和钛阴极出现裂缝(图8a，上排)。为避免钛阴极出现裂缝，在接口基底的每个阴极下方都集成了SU-8刚性平台。有了这一预防措施，SU-8硬质平台上方的像素就不会出现裂缝(图8a，底排)；图像与图1c中的绿色区域相对应。在SU-8硬质平台之间的混合薄膜内仍会出现裂缝，但这并不那么重要，因为该区域已被PDMS封装，以防止分层，而且在阴极定义区域外光产生的载流子不会对电极/电解质界面产生的光电势/电流产生重大影响。然后，我们使用KPFM测量表面电位的变化(图8b)。由于假体呈半球形，原子力显微镜针尖只能触及假体顶部的电极(直径80微米，开口67微米)。与平面PDMS表面相比，照明引起的表面电位变化没有统计学差异(图8c)。

为了模拟POLYRETINA植入后的寿命，我们将其浸泡在87°C的生理盐水溶液中进行了功能性加速老化测试(图8d)。在老化开始前和实验过程中的几个时间点，用KPFM测量了光照后表面电位的变化(图8e)。在加速老化24个月前，平均表面电位无统计学意义变化。加速老化说明其使用寿命至少为2年。最后，根据ISO 10993-5：医疗器械的生物学评价，通过提取小鼠成纤维细胞L929进行体外细胞毒性评价。通过XTT细胞活力测定法估计细胞活力。结果显示假体的存活率为100%，阳性对照为0.3%，阴性对照为100%。通过体外细胞毒性评价结果说明，它对细胞没有毒性。