边界层梯度的计算方法是表层水(1000μm)与边界层(始终位于卵囊表面)最低氧气、pH值或最高氨浓度之差。

系列I：发育中胚胎或幼鱼边界层的水化学特征

对15-16dpf(n=8-13)、22-23dpf(n=8-13)和29-30dpf(n=8-14)的胚胎以及29-30dpf(n=5-8)和43-44dpf(n=10-14)的幼鱼进行了边界层测量。幼鱼被轻度麻醉[50mg/l三卡因甲磺酸盐(MS-222)]以防止移动。这种低浓度的MS-222能阻止鳍的运动，但不能阻止耗氧量。

系列II：卵囊的存在

为确定卵囊的存在对边界层条件的影响，用25号针头刺穿29-30dpf胚胎(n=4-8)的卵囊，并注入少量红色染料(食用色素)以标记切口点。然后迅速将微电极放入卵囊内，测量PVF中的氧气、pH值或氨。边界层梯度的计算方法是取PVF与自由流动水(完整胚胎)之间的差值，并与29-30dpf相同发育时间的孵化胚胎(幼鱼)梯度(卵囊表面减去自由流动水)进行比较(n=8-14)。

系列III：胚胎拥挤对边界层条件的影响

图1虹鳟胚胎拥挤装置示意图。边界层测量取自中央目标胚胎。目标胚胎周围有(a)六个活胚胎或(b)六个直径约5毫米的塑料假胚胎或(c)无胚胎。

为确定胚胎拥挤对边界层条件的影响，对26-29dpf胚胎(n=6)进行了实验。测试胚胎被放置在一个铁丝环的中心，周围有六个其他胚胎，让边界层形成30分钟(图1)。对中央单个测试胚胎的边界层进行测量。天然胚胎的拥挤会通过增加湍流影响水流条件，并通过代谢作用影响水化学。因此，在测试胚胎周围放置了六个假胚胎，即与天然胚胎尺寸大致相同的塑料球(直径5毫米)，然后重复实验。假胚胎通过改变测试胚胎附近的水流来模拟天然河床产卵区中的拥挤现象，但不会对水的化学成分产生生物影响。第三组测量是在没有拥挤的情况下对单个测试胚胎进行的。每次处理后都会冲洗系统，以清除代谢废物并补充氧气。

统计分析

使用SigmaPlot11.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析确定不同发育阶段(系列I)和有无卵囊(系列II)之间边界层梯度的显著差异。在系列I中，封装胚胎(15-30dpf)与孵化幼鱼(30-44dpf)分开测试，因为前者的测量是从卵囊表面进行的，而孵化幼鱼的测量是从卵囊表面进行的。采用单向重复测量方差分析确定胚胎拥挤实验(系列III)中边界层梯度的显著差异。采用Tukey后检验确定差异显著的组别(P<0.05)。结果以平均值±S.E.表示。在适当情况下，使用平方根函数对数据进行转换，以平衡方差。

结果

图2 (a、c、e)发育中的虹鳟胚胎[受精后15(△)天、22(灰○)天和29(黑□)天]和(b、d、f)幼鱼苗[受精后30(◇)天和43(●)天]的边界层。在胚胎和幼鱼苗的边界层测量(a,b)氧气(O2)、(c,d)pH值和(e,f)氨(NH4+)。边界层梯度的计算方法是边界层中最低氧气浓度、pH值或最高NH4+浓度与表层水的差值。数据以平均值±s.e.表示(n=4-14)。梯度的显著差异采用单因子方差分析和Tukey后检验(P<0.05)。小写字母表示胚胎边界层梯度的显著差异。*，30和43dpf幼鱼边界层梯度的显著差异。

在系列I(发育系列)中，胚胎的氧梯度在29dpf显著高于22和15dpf[单因子方差分析，F2,37=9.162，P<0.001；图2(a)]，幼鱼的氧梯度在43dpf显著高于30dpf[单因子方差分析，F1,20=69.012，P<0.001；图2(b)]。同样，胚胎发育后期(29dpf)的pH梯度明显高于早期阶段[15和22dpf；单因素方差分析，F2,31=4.659，P<0.05；图2(c)]，43dpf幼鱼的pH梯度也明显高于30dpf幼鱼[单因素方差分析，F1,16=17.855，P<0.001；图2(d)]。胚胎和幼鱼发育过程中的氨梯度没有明显差异[单因素方差分析，F2,21=2.841，P>0.05和F1,15=0.248，P>0.05；图2(e)，(f)]。

图3 虹鳟胚胎细胞周液(PVF)与自由流水之间或鱼苗卵囊表面与自由流水之间的梯度。(a)氧(O2；n=8)、(b)pH(n=4-5)和(c)氨(NH4+；n=6-7)的测量是在相似的发育阶段(29-30dpf)进行的。用单向方差分析和Tukey后宿主检验确定梯度的显著差异(P<0.05)。*，卵囊和PVF梯度之间存在显著差异。

在系列II(存在或不存在卵囊)中，包膜胚胎的PVF与自由流动的水之间的氧梯度显著高于同一发育时间刚孵化胚胎的卵囊表面与自由流动的水之间的梯度[单因子方差分析，F1,14=262.780，P<0.001；图3(a)]。包膜胚胎的pH和氨梯度也明显高于刚孵化的胚胎[单因素方差分析，F1,7=83.319，P<0.001和F1,11=10.304，P<0.01；图3(b)，(c)]。

图4 (a)单个虹鳟胚胎边界层的氧气(O2)、pH值和氨(NH4+)梯度，假拥挤或胚胎拥挤处理。在拥挤处理中，胚胎被六个假胚胎或六个活胚胎拥挤。数据以平均值±s.e.表示(n=6)。使用重复测量单因素方差分析和Tukey后检验(P<0.05)可发现显著差异。小写字母表示处理组之间存在显著差异。

在系列III(胚胎拥挤)中，单个胚胎的氧气梯度明显低于假胚或胚胎拥挤处理[单向重复测量方差分析，F2,10=94.700，P<0.001；图4(a)]。与单个胚胎处理相比，两种拥挤处理的pH边界层梯度都明显更高[单因子重复测量方差分析，F2,10=31.894，P<0.001；图4(b)]。此外，与单胚胎处理相比，胚胎拥挤处理的氨边界层梯度明显更高，而假拥挤处理的氨边界层梯度则不高[单因子重复测量方差分析，F2,10=6.846，P<0.05；图4(c)]。