摘要

测试的假设是，胚胎代谢会影响边界层的水化学。此外，胚胎拥挤会进一步加剧新陈代谢对边界层水化学的影响。随着发育的进行，边界层中氧气和pH的梯度增加，但NH4+的梯度没有增加。卵囊的存在阻碍了O2向胚胎的扩散以及H+和NH4+向胚胎的扩散。当胚胎被假胚胎或活胚胎包围时，O2、pH和NH4+边界层梯度的大小明显增加。这种对胚胎边界层的拥挤效应大部分是由于水流的变化而不是直接由于新陈代谢造成的。这些结果清楚地表明，随着卵囊的存在，发育中的虹鳟胚胎附近的微环境会变得更加停滞，而胚胎拥挤则会进一步加剧这种停滞。

引言

在湖泊、河流和溪流中，鲑科胚胎在被称为河床产卵区的砾石穴中发育。雌性鲑科通常会选择水流相对较急的水系，但河床产卵区内的水流可能比地表水低两个数量级。低水流的一个后果是，小型水生生物(如鱼类胚胎)附近的边界层厚度增加。边界层是胚胎卵囊或绒毛膜附近的半停滞(无搅拌)水层，是胚胎与环境之间的界面。边界层对于进行切面呼吸的生物来说更为重要。鲑科胚胎在孵化后很长时间内都会通过皮肤外表面进行气体交换。之前的研究表明，虹鳟鱼胚胎周围存在氧气边界层，随着胚胎的发育，边界层梯度的大小会随着新陈代谢的增加而增加。同样，发育中的胚胎排出的呼吸废物(如氨、CO2和H+)可能会在靠近胚胎的边界层积聚。

早期阶段发生在卵囊中的事实也可能加剧发育中胚胎附近的停滞微环境。卵囊是一种无细胞外壳，具有跨膜孔道，允许水和无机离子等小分子质量的分子运动，但不允许较大的蛋白胶体运动。尽管小分子可通过这些孔道自由移动，但卵囊还是为氧气创造了一个扩散分区，因此相对于卵囊表面而言，细胞周液(PVF)中的氧气浓度要低得多。同样，卵囊也可能延迟代谢废物的有效清除，因此，浸泡胚胎的PVF中的氨、CO2和H+浓度会升高。在以前对虹鳟的研究中，结果表明孵化前胚胎的PVF pH值和氨水平与外部环境不同，但未对无囊胚胎进行匹配测量。

另一个可能强烈影响河床产卵区水化学的重要因素是胚胎拥挤。据了解，一个卵囊中相邻的鲑科胚胎数量可达900-1300个。在各种无脊椎动物和脊椎动物中，当胚胎拥挤在巢穴中时，相邻的个体会消耗氧气并降低pH值。据了解，对自然、拥挤的鲑科河床产卵区中氧气耗尽和废物积累的微观测量尚未发表，这可能是因为技术上的困难，如在不干扰正常水流的情况下将胚胎置于砾石底层之下。从理论上讲，低水流或拥挤会增加边界层效应，有可能影响鲑科胚胎的生长和发育。在以前对鲑科胚胎进行的实验室研究中，水流的两倍变化会导致氧气边界层梯度的相应变化，但没有考虑邻近胚胎的影响。因此，本研究的目的之一是在受控实验室条件下描述胚胎拥挤的影响。

测试的假设是，胚胎代谢会影响边界层的水化学。据预测，在发育后期，边界层的pH值(也包括氧气含量)会进一步下降，边界层的氨浓度会进一步上升。另一个预测是，胚胎拥挤会加剧新陈代谢对边界层水化学的影响。为了验证这两个预测，我们测定了氧气、pH值和氨的边界层梯度。为了测试发育的影响，测量了受精后15-16天、22-23天和29-30天(dpf)的虹鳟胚胎以及29-30天和43-44天(10℃)的幼鱼的边界层梯度。为了验证胚胎拥挤的预测，对单个胚胎的边界层梯度进行了测量，周围是处于同一发育阶段的活胚胎或假胚胎，以控制任何水流干扰效应。根据预测，胚胎拥挤处理会增加整体代谢活动并影响水流，而假胚胎只会影响水流条件，不会对生物产生影响。

材料与方法

实验动物

虹鳟胚胎在受精当天从虹鳟鱼养殖场购买，然后运到安大略省圭尔夫市圭尔夫大学的哈根水产实验室。胚胎被放置在Heath托盘中，托盘中的井水流动温度为10℃[O2 0.31mmol/l，pH7.9，CaCO3水硬度为411mg/l，离子浓度(mmol/l)：2.6Ca2+、1.5Cl-、1.5Mg2+、0.06K+和1.1Na+]，条件与该地区鲑科产卵栖息地相似。在这些条件下，胚胎在14dpf长出眼睛，在29至30dpf之间孵化。来自三个不同雌性的胚胎由多个雄性受精，以增加后代的遗传变异性。

实验步骤

进行了三个系列的实验：系列I，发育中的胚胎或幼鱼边界层的水化学；系列II，有卵囊或无卵囊的胚胎边界层的水化学；系列III，胚胎拥挤对边界层条件的影响。

实验时，将胚胎放置在一个有机玻璃室(长7.5厘米×宽3.3厘米×深2厘米)中，以每分钟4毫升的速度提供流动的冷冻(10℃)充气循环井水，并静置30分钟，以便形成边界层。事实证明，这足以形成氧气边界层。边界层测量是通过安装在微机械手上的氧气、pH值或氨微电极进行的。微电极尖端直径为25-50微米，90%的响应时间为2-4秒。两次测量之间有30秒的稳定期。测量在胚胎的卵囊表面或幼鱼的卵囊上进行，以100μm为间隔缩回至1000μm。关于鱼类幼鱼的主要交换区域，文献中的报道相互矛盾。Rombough报告说，所有皮肤区域的摄氧量大致相同，而其他研究则表明，卵囊表面是体内离子(H+和NH4+)移动最多的区域。鉴于这些差异，我们选择对卵囊的边界层条件进行测量。

在初步试验中，尝试使用手工制作的微电极测量边界层中的CO2水含量。但这些微电极不稳定，测量结果不可靠，而且水中CO2浓度较低，也给测量带来了困难。因此，放弃了直接测量CO2。通过测量边界层的pH值，结合直接排出的H+和排出的CO2部分水合在水中产生的H+进行了测量。

使用商用微电极(Unisense)测量氧气。在拥挤实验(系列III)中，使用了氧针探针(Lazar)。为校准氧电极，使用了无氧校准溶液(2mol/l Na2SO3)和100%氧饱和溶液，如先前报告所述。在测量pH值和氨时，微电极是根据O'Donnell和Litwiller等人的方法在实验室制备的。为了校准pH值微电极，使用了在井水中制备的10mmol/l Hepes缓冲溶液，并用0.1mmol/l NaOH或0.1mmol/l HCl调节pH值至8.5和6.5(或至少相差1个pH单位)。氨的测量是在人工井水中进行的，井水中的钾离子和钠离子浓度较低，因为这些离子会干扰氨选择性离子膜。先前的研究表明，不含Na+的水并不会改变虹鳟胚胎的氨排泄率。人工井水是用反渗透水(pH值7.9)制备的，其离子成分如下(毫摩尔/升)：0.8 MgSO4、0.7 MgCl2、2.6 CaSO4和0.1 NaHCO3。校准溶液由0.01、0.10和1.00mmol/l NH4Cl人工井水组成。