不同的CcoN亚基在菌落发育的早期或晚期对竞争适应性是必需的

为了进一步测试CcoN4对生物膜生长的贡献，我们进行了竞争实验，其中△N4和其他突变体与野生型一起作为混合菌株生物膜生长。在每个实验中，一个菌株用组成型表达的YFP标记，以便在菌落形成单位（CFUs）计数期间区分菌株。实验在每种菌株上标记进行，以确认YFP表达不影响适应性（图3-图补充1A,B）。当在菌落生长3天后评估竞争适应性时（图3A），ΔN4细胞显示出劣势，野生型以两倍的优势胜过ΔN4。这与在AN1AN2突变体中观察到的劣势相似，进一步表明孤儿亚基CcoN4在生物膜代谢中起重要作用。

图3 CcoN4在生物膜中具有竞争优势，尤其是当O2成为限制条件时。(A)与WT在混合菌株生物膜中共同培养3天后，各种YFP标记的cco突变体的相对适应性。(B)显示各种cco突变体与WT在混合菌株生物膜中共同培养3天的相对适应性的时间过程。图中显示的是WT与各种"标记"菌株(即设计为组成型表达YFP的菌株)共培养的实验结果。(已标记的WT与未标记的突变体共培养的实验结果见图3-图补充1)。误差条代表生物三倍体的标准偏差。(C)通过薄片和DIC显微镜评估WT和Δphz的菌落生物膜在3天发育过程中的厚度变化。开始起皱后，测定基部(即皱纹之间的"谷")的厚度。(D)生物膜形成最初3天内选定时间点的菌落O2曲线。灰色点标记表示在菌落正下方的琼脂中进行的测量。

DIC成像显示野生型菌落薄切片在深度上存在形态变化，这可能是由于O2可用性降低所致（图3-图补充1C）。我们先前报道过，3天龄的PA14菌落生物膜在深处是缺氧的（Dietrich et al.,2013），并且在较薄的生物膜（如吩嗪缺失突变体Aphz形成的生物膜）中O2可用性通常更高。我们提出，在野生型生物膜中利用吩嗪作为电子受体使缺氧区的细胞生存成为可能，并促进菌落生长（Okegbe et al.,2014）。△N4突变体在竞争分析中相对较晚出现的表型（图3B）使我们推测CcoN4可能在缺氧菌落亚区形成期间的生存中起作用，并且该区域可能在菌落生长1到2天之间出现。我们测量了野生型和Aphz生物膜在发育过程中特定时间点的O2浓度。

含CcoN4的异构体对PA14毒力具有独特贡献

我们之前已经证明，一个在生物膜特异性吩嗪生产中缺陷的突变体（其菌落形态也发生改变（Dietrich et al.,2008;2013））表现出毒力下降（Recinos et al.,2012）。我们和其他人提出，吩嗪可能通过作为电子受体在感染期间遇到的缺氧条件下平衡细胞内氧化还原状态来促进毒力（Price-Whelan et al.,2006;Newman,2008;Dietrich et al.,2013）。由于CcoN4是野生型生物膜结构和呼吸作用所必需的（图2A、C和图5C），我们假设它也可能有助于毒力。为了验证这一点，我们使用线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为宿主进行了毒力测定。研究表明，铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫具有致病性，并且缓慢致死模型模拟了细菌对秀丽隐杆线虫的类似感染性杀死（Tan et al.,1999）。虽然△N1AN2以类似野生型的动力学杀死线虫，但△N1ΔN2ΔN4和△cco1cco2相对于野生型PA14表现出同样受损的杀死能力（图6）。

图6含CcoN4的同工酶对PA14的毒力有独特贡献WT、gacA和各种cco突变株在线虫秀丽隐杆线虫中的缓慢杀灭动力学。暴露于WT PA14的秀丽隐杆线虫群体在接触该细菌4天后几乎100%死亡，而缺乏GacA(一种控制铜绿假单胞菌毒力基因表达的调节因子)的突变体则显示杀灭率下降，暴露后4天仍有约50%的蠕虫存活。(A)与WT相比，ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2的致病性明显减弱。误差条代表至少6个生物重复的标准偏差。暴露后2.25天，ΔN1ΔN2ΔN4杀死的elegans明显少于WT(非配对双尾t检验；p=0.0022)。(B)与WT相比，ΔN1ΔN2的致病性仅略有降低。暴露后2.25天，ΔN1ΔN2杀死的elegans明显多于ΔN1ΔN2ΔN4(非配对双尾t检验；p=0.003)。误差条代表至少4个生物重复的标准偏差，每个重复的起始样本量为30-35个蠕虫。

讨论

生物膜形成通常与宿主的定植和在宿主体内的持续存在相关，包括在囊性纤维化患者中观察到的慢性肺部定植（Tolker-Nielsen,2014;Rybtke et al.,2015）。生物膜微环境内发现的条件与充分混合的液体培养物中的条件在电子供体和受体可用性方面是不同的。我们先前描述了由铜绿假单胞菌产生的电子穿梭抗生素吩嗪在生物膜特异性代谢中的作用。在本研究中，我们关注铜绿假单胞菌编码cbb3型细胞色素氧化酶亚基的大量基因补体，并着手测试它们对生物膜中代谢电子流的贡献。

铜绿假单胞菌基因组包含四个不同的ccoN同源物，编码cbb3型氧化酶的催化亚基。其中只有两个（ccoN1和ccoN2）与编码活性cbb3型氧化酶另一关键成分的ccoO同源物共转录（图1B）。然而，遗传学研究已经证明，在铜绿假单胞菌PAO1中，所有四个版本的CcoN都可以在表达时与两个CcoO同源物中的任何一个形成功能性复合物（Hirai et al.,2016）。在充分混合的液体培养物中，缺乏“孤儿”亚基的突变体没有显示出生长缺陷（图2C）（Hirai et al.,2016）。因此，我们惊讶地发现，在菌落生物膜分析中，△N4突变体显示出独特的形态（图2A，图2-图补充1A）。我们在研究细胞氧化还原平衡和感应的机制时广泛使用了该分析，并注意到△N4的表型类似于电子穿梭和氧化还原信号缺陷突变体的表型（Dietrich et al.,2013;Okegbe et al.,2017）。

我们通过一系列分析表征了ΔN4突变对生物膜生理学的影响。在充分混合的液体培养物中，Dcco1cco2显示出与DN1AN2相似的生长表型。虽然Hirai等人已证明在浮游生长条件下，野生型铜绿假单胞菌培养物确实形成含有CcoN4的Cco异质复合物，但我们的观察表明，这些复合物在这些条件下对生长的贡献不显著。与此一致，在ΔN1ΔN2背景中删除ccoN4对浮游生长没有影响（图2C）。然而，在基于生物膜的实验中，我们发现单独删除N4就足以引起形态表型的改变（图2A和图2-图补充1A），并且在DN1或AN1AN2背景中删除N4深刻影响了生物膜生理学。这些实验包括对菌落呼吸活性的量化，其中删除CcoN4导致显著降低（图2B）；生物膜共培养，其中CcoN4是竞争适应性所必需的（图3A和B，图3-图补充1）；氧化还原分析，显示CcoN4可以促进吩嗪还原（图5B，上图）；菌落厚度测量，显示CcoN4是缺氧和缺氧区形成所必需的（图5B，下图）；以及基质分析，显示CcoN4有助于抑制Pel多糖的产生（图5C）。在菌落薄切片中观察到的cco1、cco2和ccoN4Q4在表达区域上的重叠（图4）意味着CcoN4可以与Cco1和Cco2亚基形成跨越菌落深度的异质复合物，并以这些方式影响铜绿假单胞菌生物膜的生理学。

图4 cco基因随生物膜深度的不同而表达不同。左图：从生长了3天的WT生物膜中制备的薄切片的代表性图像。每个生物膜都在cco1、cco2或ccoN4Q4启动子的控制下表达转译GFP报告基因。报告荧光显示为绿色，并覆盖在相应的DIC图像上。右图与左侧图像相对应的荧光值。各图中均减去了含有gfp基因但无启动子的菌株(空MCS对照)的荧光值。图中还显示了生长3天的WT生物膜的O2浓度随深度变化的情况(开放圆圈)。

本研究报告的突变体表型和基因表达谱表明了CcoN4在生物膜特定环境下对O2和吩嗪还原的作用，并使我们能够对其他CcoN亚基的作用得出结论。ccoN4Q4在整个生物膜深度上的表达表明含CcoN4的异构体可能参与有氧和缺氧区域的细胞色素c氧化（图4）。这偏离了先前发表的观察结果，即与充分通气的液体培养物相比，这些基因在缺氧液体培养物中特异性诱导（Alvarez-Ortega and Harwood,2007）。因此，我们在菌落相对含氧的上部区域观察到的ccoN4Q4表达可能是生物膜特有的。

AN4显示出表明氧化还原应激的菌落形态，并且与野生型相比具有适应性劣势（图2A和图3A,B，图5B下图，图3-图补充1）。然而，由于它在吩嗪还原方面没有缺陷（图5B，上图），我们将其菌落形态和受损的适应性表型归因于其在O2还原中提出的作用（Hirai et al.,2016）。类似地，ΔN1ΔN2显示出相对于野生型的适应性降低（图3A和B，图3-图补充1），同时显示出与野生型相当的吩嗪还原（图5B），这意味着其中一个或两个亚基有助于生物膜中的O2还原。然而，当CcoN4与CcoN1和CcoN2一起被删除时，所得菌株表现出严重的吩嗪还原缺陷，删除两个cco操纵子重现了这一表型（图5B）。因此，我们的观察表明cbb3型氧化酶在吩嗪还原中的作用，除了其已确立的O2还原作用之外，从而扩展了我们对它们在铜绿假单胞菌生理学和生存中整体贡献的理解。

图5 PA14 WT和突变体菌落生物膜中化学梯度和基质分布的特征。(A)左图：生长两天的WT和Δphz生物膜的氧气浓度(蓝色)和氧化还原电位(橙色)随深度的变化。WT生物膜厚约150μm，而Δphz生物膜厚约80μm。对于O2曲线，误差条代表生物三重样的标准偏差。对于氧化还原曲线，数据代表至少5个生物重复。右图：描述生物膜中O2和还原与氧化酚嗪类分布的模型。(B)顶部：生长2天的WT和各种突变生物膜的氧化还原电位随深度的变化。至少5个生物重复的数据具有代表性。下图所述菌株3天菌落生物膜的厚度。(C)左图：WT和cco突变体生物膜的代表性薄切片，用凝集素染色并用荧光显微镜成像。生物膜在取样前已生长2天。右图凝集素染色信号强度的相对量化。左侧面板中菌株名称的颜色为绘制数据提供了一个关键，右侧面板中的y轴为左侧面板提供了一个刻度条。凝集素染色图像和数值代表4个生物重复。

这里描述的结果可以启发我们理解细胞如何在生物膜微环境内的不同条件下生存。先前的工作表明，丙酮酸发酵可以支持铜绿假单胞菌在缺氧条件下的生存（Eschbach et al.,2004），并且吩嗪促进这一过程（Glasser et al.,2014）。额外的研究表明，吩嗪还原是由铜绿假单胞菌黄素蛋白和脱氢酶偶然催化的（Glasser et al.,2017）。我们观察到cbb3型细胞色素氧化酶，特别是含有CcoN1或CcoN4亚基的那些，是在缺氧生物膜亚区吩嗪还原所必需的（图5B），这进一步将电子传递链与这些化合物的利用联系起来。考虑到吩嗪在细胞色素bc1复合物和细胞色素氧化酶的生化研究历史上作为介导剂的作用，这也很有趣（King,1963;Armstrong and Stewart-Tull,1971;Davidson et al.,1992）。基于这些早期工作，我们可以推测不同的CcoN亚基可能间接影响吩嗪还原，这可能发生在CcoO亚基的细胞色素c结合位点或电子传递链的其他地方，通过这些CcoN亚基对呼吸复合物的整体功能或稳定性产生影响。最终，在不同的生物膜深度或取决于电子供体可用性，吩嗪还原和吩嗪相关代谢的各种机制可能都是相关的。我们的结果表明，在菌落生物膜系统中，传统上被认为是O2还原特异性的酶复合物可能有助于厌氧生存。

由于生物膜形成通常与宿主的定植和持续存在相关，我们测试了CcoN4是否有助于铜绿假单胞菌在秀丽隐杆线虫中的致病性。类似于我们在生物膜分析中的观察，我们发现Acco1cco2突变体比ΔN1ΔN2突变体表现出更严重的表型，表明孤儿亚基可以替代由cco1和cco2操纵子编码的亚基。我们还发现在ΔN1ΔN2中删除ccoN4导致了类似Dcco1cco2的表型，表明CcoN4是可以发挥这一作用的亚基（图6）。在O2可用的宿主微环境中，含CcoN4的异构体可能有助于其还原。此外，在缺氧区域，含CcoN4的异构体可能促进吩嗪还原，从而实现细胞氧化还原平衡。这两种功能都将有助于细菌在宿主体内的持续存在。cbb3型氧化酶对铜绿假单胞菌致病性的贡献提出了干扰Cco酶功能的化合物可能成为这些感染有效疗法的可能性。由于它们对细菌呼吸链的特异性，此类药物将是极具吸引力的候选药物，因此不会影响宿主的内源性呼吸酶。

我们发现一个孤儿cbb3型氧化酶亚基有助于生物膜生长，这进一步扩展了铜绿假单胞菌显著呼吸灵活性的范围。除了末端酶复合物水平的模块性（例如利用aa3-型与cbb3-型氧化酶），铜绿假单胞菌呼吸链的活性还受到孤儿cbb3型催化亚基替代天然亚基的进一步影响。利用含CcoN4的异构体促进了吩嗪还原活性，并可能影响铜绿假单胞菌生物膜中的有氧呼吸。对于包含孤儿cbb3型催化亚基的特殊物种来说，这种精细的控制水平在覆盖广泛电子受体可用性范围的环境（Cowley et al.,2015）中生长和生存可能特别有利。