结果

一小部分细菌基因组在部分（“孤儿”）操纵子中编码cbb3型氧化酶亚基

生化、遗传和基因组分析表明，通常由操纵子编码的CcoN和CcoO亚基形成cbb3型氧化酶的最小功能单元（Ducluzeau et al.,2008;de Gier et al.,1996;Zufferey et al.,1996）。CcoN是膜整合的催化亚基，包含两个b型血红素和一个铜离子。CcoO是膜锚定的，包含一个c型血红素。额外的氧化还原亚基和/或参与复合物组装的亚基，如CcoQ和CcoP，可以由相邻基因编码（图1B）。ccoNO包含的簇广泛分布于细菌域的多个门（Ducluzeau et al.,2008）。我们使用EggNOG数据库（包含超过3000种细菌物种的代表性基因组（Huerta-Cepas et al.,2016））来获取关于cco基因存在和频率的概览。在查询的3318个细菌基因组中，我们发现467个具有完整的cco操纵子（编码具有O和N亚基的潜在功能性cbb3型氧化酶）。其中，78个包含多于一个完整的操纵子。我们还使用EggNOG通过检查单个基因组中ccoO和ccoN同源物的相对数量来寻找孤儿ccoN基因。我们发现了14个基因组，其中假单胞菌属物种占比过高，它们包含孤儿ccoN基因（图1C），我们的分析产生了三个包含不止一个孤儿ccoN基因的物种：门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）。门多萨假单胞菌是一种土壤细菌和偶发的医院病原体，基于16S rRNA基因序列比较（Anzai et al.,2000）与铜绿假单胞菌密切相关。相反，木糖氧化无色杆菌属于一个不同的变形菌纲，但尽管如此，它经常被误认为是铜绿假单胞菌（Saiman et al.,2001）。与铜绿假单胞菌类似，它是一种机会性病原体，可在免疫功能低下个体和囊性纤维化患者中引起肺部感染（De Baets et al.,2007;Firmida et al.,2016）。Hirai等人先前报道了基于ClustalW对假单胞菌属CcoN同源物的分析，表明在EggNOG数据库中未代表的额外物种中也存在孤儿基因。这些包括反硝化假单胞菌（P.denitrificans），它包含两个孤儿基因（Hirai et al.,2016）。

含CcoN4的异源复合物对形态发生和呼吸作用具有生物膜特异性贡献

在生物膜中生长期间，细胞群体会遇到不同的电子供体和受体可用性条件，这与其在充分混合的液体培养物中遇到的条件不同。我们因此使用菌落形态分析研究了单个cco基因和基因簇对铜绿假单胞菌PA14生物膜发育的贡献，该分析已证明对电子受体可用性和利用具有敏感性（Dietrich et al.,2013）。由于Cco1和Cco2复合物是铜绿假单胞菌在充分通气和O2限制的液体培养物中生长最重要的细胞色素氧化酶（Alvarez-Ortega and Harwood,2007;Arai et al.,2014），我们预测使Cco1和Cco2功能失活的突变会影响菌落生长。确实，缺乏cco1和cco2操纵子的突变体（‘Acco1cco2’）产生了比野生型更薄的生物膜，直径更小。发育5天后，该突变体表现出显著的表型，包括一个高大的中央环状结构，周围环绕着向外辐射的短脊（图2A，图2-图补充1A）。Dcco1cco2菌落颜色也更深，表明吸收刚果红染料增加，该染料与生物膜产生的胞外基质结合（Friedman and Kolter,2004）。令人惊讶的是，特异性缺失Cco1和Cco2催化亚基的菌株（‘ΔN1ΔN2’），虽然在液体培养中显示出与Acco1cco2相似的生长缺陷（图2C），但在生物膜发育方面与野生型相似（图2A，图2-图补充1A）。

图2含CcoN4的异质复合体对生物膜的形态发生和呼吸有特异性贡献。(A)上层：PA14 WT和cco突变株五天大的菌落生物膜。生物膜形态代表10个以上的生物重复。图像使用数码显微镜生成。比例尺为1厘米。下层：上图所示生物膜的三维表面图像。图像使用广域三维测量系统生成。高度刻度线：从底部(蓝色)到顶部(红色)，WT、ΔN1ΔN2和ΔN4为0-0.7；ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2为0-1.5毫米。(B)WT和cco突变体菌落生长1天后的TTC还原。还原时，TTC发生不可逆的颜色变化，从无色变为红色。条形图代表单独绘制的生物重复(n=5)的平均值，误差条代表标准偏差。(C)PA14 WT和cco突变株在含20mM琥珀酸的MOPS定义培养基中的平均生长情况。误差条代表生物三重复的标准偏差。

由于已知在铜绿假单胞菌PAO1中，CcoN3和CcoN4可以与Cco1和Cco2氧化酶的亚基形成功能性复合物（Hirai et al.,2016），这使我们假设含有孤儿亚基CcoN3和/或CcoN4的Cco异构体可以在生物膜背景下替代Cco1和Cco2。删除ccoN3（‘△N3’或‘△N1AN2AN3’）在突变体与相应亲本菌株比较时未观察到对生物膜发育的影响（图2-图补充1A）。然而，‘△N1△N2△N4’突变体的表型符合我们的模型，因为它在液体培养和生物膜生长中都模拟了Acco1cco2突变体（图2A和C，图2-图补充1A）。此外，我们发现仅缺失ccoN4的突变体（‘△N4’）显示出改变的表型，即它比野生型更早开始形成皱纹结构（图2-图补充1A），最终发展成一个中央环内皱纹无序区域，周围环绕着长而向外辐射的脊（图2A）。将ccoN4基因重新引入这些菌株中的任何一个都恢复了相应亲本菌株的表型（图2-图补充1A）。在△N4背景下删除ccoN2或ccoN3都没有加剧仅在△N4中观察到的菌落表型。然而，‘ΔN1ΔN4’双突变体显示出相对于△N4和△N1AN2AN4的中间表型（图2-图补充1B），表明CcoN1和CcoN4存在一定的功能冗余。△N4菌落的发育模式让人联想到吩嗪生产和感应缺陷突变体的模式（图2-图补充1A）（Dietrich et al.,2008;2013;Sakhtah et al.,2016;Okegbe et al.,2017）。尽管△N4本身在菌落形态分析中显示出独特的表型，但其在振荡液体培养物中的生长与野生型无法区分（图2C）。最后，删除三种非cbb3型末端氧化酶（‘AcoxAcyoAcio’）并未影响生物膜形态（图2-图补充2C）。这些结果表明，含CcoN4的Cco异构体可能在生物膜中发挥特定的生理作用。

接下来，我们询问CcoN4是否有助于生物膜中的呼吸作用。我们测试了一系列cco突变体对氯化三苯基四氮唑（TTC）的还原能力，该活性与细胞色素c氧化酶依赖性呼吸相关（Rich et al.,2001）。Acco1cco2突变体在TTC还原方面表现出严重缺陷，ΔN1ΔN2ΔN4突变体重现了这一缺陷。与菌落形态分析一样，仅缺失CcoN1和CcoN2的突变体并未重现这种极端表型，表明CcoN4有助于PA14生物膜中的呼吸活性。虽然我们在△N4突变体中没有检测到TTC还原缺陷，但我们观察到ΔN1ΔN4的TTC还原水平介于ΔN1ΔN2和ΔN1ΔN2ΔN4之间，进一步表明CcoN4亚基参与此活性（图2B）。

最近的一项研究证明了CcoN4在抵抗氰化物中的作用，氰化物是铜绿假单胞菌产生的一种呼吸毒素（Hirai et al.,2016）。因此，ΔN4突变体改变的生物膜表型可能归因于其在生物膜生长期间对产生的氰化物敏感性增加。我们删除了hcn操纵子（编码氰化物生物合成酶），在野生型、吩嗪缺失（Aphz）和各种cco突变体背景下进行了测试。这些菌株的生物膜形态和液体培养生长不受△hcnABC突变的影响，表明本研究中探索的CcoN4的生物膜特异性作用与其在介导氰化物抗性中的作用无关（图2-图补充2）。此外，我们检查了假单胞菌基因组数据库中可用的基因组中编码CcoN亚基（ccoN基因）和氰化物合成酶（hcnABC）（Winsor et al.,2016）的同源物存在情况，并未发现hcnABC和ccoN4同源物之间存在明确的相关性（图2-图补充3）。

总之，我们在菌落形态发生和TTC还原分析中观察到的cco基因突变效应表明，一种或多种含CcoN4的Cco异构体支持呼吸作用和氧化还原平衡，并且在生物膜中，与含CcoN1和CcoN2的Cco复合物相比，其优先被利用。我们对PA14基因组编码的CcoN亚基进行了序列比对，并鉴定了CcoN4特有或CcoN4与CcoN1（在我们的分析中显示出与CcoN4最强的功能冗余）共有的独特残基（图2-图补充4A）。我们还利用施氏假单胞菌CcoN亚基的可用结构（Buschmann et al.,2010）对CcoN4序列进行了穿线法建模，并高亮了这些残基（图2-图补充4B）。值得注意的是，大多数高亮的残基暴露在表面，特别是在预测的CcoN4结构的一半上，它们可能在那里结合未知的蛋白质伴侣或特定脂质。相反，被描述为与CcoO和CcoP相互作用的位点大部分是保守的，进一步支持了CcoN4可以在Cco复合物中与这些亚基相互作用的观点。