竞争性试验

荧光菌株(表达YFP)和非荧光菌株的隔夜预培养物在LB中按1:100稀释(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2按1:50稀释)，并培养至生长中期(500nm时的OD值为0.5)。用Spectronic 20D+分光光度计(Thermo Fisher Scientific)读取500nm处的精确OD值，并将培养物调整至相同的OD值。然后将调整后的培养物按荧光与非荧光细胞1:1的比例混合，并将10毫升混合物点在菌落形态板上，按上述方法培养3天。在指定时间点收集生物膜，将其悬浮在1毫升1%的胰蛋白胨中，并在珠磨式匀浆器的"高"设置下进行匀浆；第1天的菌落匀浆35秒，第2天和第3天的菌落匀浆99秒。匀浆后的细胞被连续稀释，10-6、10-7和10-8稀释液被接种到1%的胰蛋白胨平板上，并在37℃下生长过夜。用TyphoonFLA7000荧光扫描仪对平板成像，确定荧光菌落数，并确定荧光菌落与非荧光菌落的百分比。

构建末端氧化酶报告程序

使用表1所列引物构建了Cco1、Cco2和CcoN4Q4操作子的转译报告构建体。使用相应的引物扩增启动子区域(感兴趣的操作子上游500bp)，在启动子的5'端添加一个SpeI消化位点，在启动子的3'端添加一个XhoI消化位点。纯化的PCR产物经消化后连接到pLD2722载体的多克隆位点(MCS)，即gfp序列的上游。质粒被转化到大肠杆菌菌株UQ950中，通过测序进行验证，并通过与大肠杆菌菌株S17-1的双亲共轭转移到PA14中。PA14单重组子在含100mg/ml庆大霉素的M9最小培养基琼脂平板(47.8mM Na2HPO4·7H2O、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.6mM NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、20mM柠檬酸钠二水合物、1.5%琼脂)上进行筛选。通过引入pFLP2质粒，利用Flp-FRT重组技术从PA14中分离出质粒骨架，并在含有300毫克/毫升羧苄青霉素的M9最小培养基琼脂平板上进行筛选，然后在不含NaCl并改良为含10%蔗糖的LB琼脂平板上进行筛选。最终克隆中gfp的存在通过PCR进行了确认。

薄层切片分析

将两层含1%琼脂的1%胰蛋白胨分别倒入4.5毫米(下)和1.5毫米(上)深处。过夜前培养物在LB中以1:100稀释(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN4、ΔN1ΔN2ΔN4、Δcco1cco2以1:50稀释)并生长2小时，直至指数期早中期。然后将5至10毫升亚培养物点在琼脂表层，将菌落置于25℃黑暗培养条件下，湿度大于90%(PercivalCU-22L)，最多培养3天。在指定的时间点，将菌落覆盖在1.5毫米厚的1%琼脂层上，准备进行薄片切片。将夹在两层1.5毫米琼脂层之间的菌落从底层取出，在50mML-赖氨酸磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中浸泡4小时(4℃)，然后在4%多聚甲醛、50mML-赖氨酸磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中固定4小时(4℃)，再在37℃下过夜。固定的菌落用PBS冲洗两次，并通过一系列乙醇清洗(25%、50%、70%、95%、3100%乙醇)脱水，每次60分钟。菌落在Histoclear-II中孵育三次，每次60分钟，然后在55℃下用100%Paraplast Xtra石蜡分别洗涤两次，每次2小时，用蜡浸润菌落，然后让菌落在4℃下聚合过夜。使用STP120组织处理器进行组织处理。使用自动显微切片机将修剪好的组织块切成垂直于菌落平面的10米厚切片，漂浮在45℃的水面上，然后收集到载玻片上。将载玻片风干过夜，在45℃的电热板上热固定1小时，然后按相反的处理顺序重新水化。将复水后的菌落立即装入TRIS缓冲DAPI：Fluorogel中，并盖上盖玻片。使用LSM700共聚焦显微镜拍摄微分干涉对比(DIC)和荧光共聚焦图像。每个菌株都以这种方式制备了至少三份生物样本。

菌落厚度测量

按上述方法制备菌落薄片，但在生长培养基中添加40毫克/毫升刚果红染料和20毫克/毫升库马西蓝染料。利用Fiji图像处理软件从共聚焦DIC图像中获得菌落高度测量值。

凝集素染色

按上述方法制备两天大的菌落进行薄片切片。将复水后的菌落用100mg/ml荧光素标记的紫藤凝集素(VectorLaboratories(Burlingame,CA)FL-1351)在PBS中染色，然后用PBS冲洗两次，用TRIS缓冲的DAPI装片并覆盖盖玻片。使用LSM700共聚焦显微镜(Zeiss)拍摄荧光共聚焦图像。

生物膜的氧化还原分析

使用25μm尖端的氧化还原微电极和外部参比电极(Unisense RD-25和REF-RM)来测量第2天(约48小时)生物膜(与菌落生物膜形态测定一样)的细胞外氧化还原状态。氧化还原微电极测量的是样品相对于参比电极吸收或释放电子的趋势，参比电极与样品生长在相同的介质中。氧化还原微电极根据制造商的说明进行校准，采用pH4缓冲液中1%喹啉酮和pH7缓冲液中1%喹啉酮的两点校准法。使用微机械手(Unisense)在整个生物膜深度每隔5μm测量一次氧化还原，测量时间为3秒，两次测量之间的等待时间为5秒。使用万用表(Unisense)和Sensor Trace曲线软件(Unisense)记录曲线。

生物膜的氧剖面分析

使用25μm尖端的氧微量传感器(Unisense OX-25)测量生物膜生长头2天内的氧浓度。在对生长3天的菌落进行氧气分析时(图4)，生物膜的生长过程与薄片分析相同。为了校准氧气微电极，使用了两点校准法。首先使用校准室(Unisense CAL300)将氧微传感器校准为大气中的氧气，校准室中装有持续冒着气泡的水。然后，使用充入N2的缺氧水溶液将微传感器校准到"零"点；为确保完全去除所有氧气，在将微传感器校准到零校准点之前，向校准室充入N2至少30分钟。然后在生物膜的整个深度进行氧气测量，测量时间为3秒，两次测量之间的等待时间为5秒。对于6个生长期的菌落，整个菌落的剖面步长为1μm；对于12小时和24小时的菌落，步长为2μm；对于48小时的菌落，步长为5μm。使用微型机械手(Unisense MM33)在生物膜内移动微型传感器，并使用万用表(Unisense)和Sensor Trace曲线软件(Unisense)记录曲线。

吩嗪定量

将过夜的预培养物以1:10的比例在LB中稀释，然后点在一个25毫米的过滤盘上(孔径：0.2μm)，过滤盘放置在一个35×10毫米的圆形培养皿中央。菌落在湿度大于90%的25℃黑暗环境中生长2天。生长2天后，将每个菌落(连同过滤盘)从各自的培养皿中取出并称重。然后在5毫升100%甲醇中过夜提取琼脂培养基中排出的酚嗪类类化合物(在黑暗中，室温下进行)。然后用0.22μm纤维素Spin-X柱过滤300μl过夜酚嗪类/甲醇提取液，并将200μl流出液装入高效液相色谱瓶。如前所述，使用高效液相色谱法(Agilent 1100 HPLC系统)对酚嗪类类化合物进行定量。

线虫致病性(慢杀)试验

慢速杀灭试验按前述方法进行。简单地说，将10μl过夜PA14培养物(如上所述生长)点到慢杀琼脂平板上(0.3%NaCl、0.35%Bacto-Peptone、1mM CaCl2、1mM MgSO4、5mg/ml胆固醇、25mM KPO4、50mg/ml FUDR、1.7%琼脂)，平板在37℃下培养24小时，然后在室温(~23℃)下培养48小时。将幼虫期4(L4)的线虫挑到PA14种子平板上，并对活虫/死虫进行长达四天的计数。每个平板被视为一个生物重复，起始样本量为30-35条线虫。