材料与方法

细菌菌株和生长条件

铜绿假单胞菌菌株UCBPP-PA14（Rahme et al.,1995）通常在溶菌肉汤（LB;1%胰蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物）（Bertani,2004）中于37°C、250 rpm振荡培养，除非另有说明。过夜培养物生长12-16小时。对于遗传操作，菌株通常在含有1.5%琼脂的固体LB上生长。本研究中使用的菌株列于表1。通常，液体预培养物用作实验的接种物。生物学重复的过夜预培养物从划线琼脂平板上的单独克隆源菌落开始。对于技术重复，单个预培养物用作亚培养物的来源接种物。

构建铜绿假单胞菌突变株

为了在铜绿假单胞菌PA14（表1）中构建无标记缺失突变体，使用表2中列出的引物扩增目标基因两侧各1 kb的序列，并通过在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）InvSc1中的间隙修复克隆（gap repair cloning）插入pMQ30（Shanks et al.,2006）。表3中列出的每个质粒都转化到大肠杆菌（Escherichia coli）菌株UQ950中，通过限制性酶切验证，并使用双亲结合（biparental conjugation）转移到PA14中。在含有100μg/ml庆大霉素的LB琼脂平板上选择PA14单交换重组子。在无NaCl并修改为含10%蔗糖的LB上选择双交换重组子（无标记缺失）。通过PCR确认缺失突变体的基因型。组合突变体是通过使用单突变体作为双亲结合的宿主来构建的，除了Dcco1cco2，它是通过同时将cco1和cco2操纵子作为一个片段删除来构建的。使用表2中列出的引物LD438和LD441扩增ccoN4的编码序列，测序验证后，以相同方式将ccoN4互补回缺失位点。

菌落生物膜形态分析

过夜预培养物按1:100稀释于LB（△N1ΔN2、△N1ΔN2ΔN3、△N1ΔN2△N4、ΔN1ΔN2ΔN4ΔN3、ΔN1ΔN2ΔN4::N4、Δcco1cco2、ΔN1ΔN2Δhcn、ΔN1ΔN2ΔN4△hcn和△cox△cyoAcio按1:50稀释）并生长至中期指数相（OD500nm≈0.5）。将10微升亚培养物点种到含有60毫升菌落形态培养基（1%胰蛋白胨，1%琼脂[Teknova(Hollister,CA)A7777]，含40μg/ml刚果红染料[VWR(Radnor,PA)AAAB24310-14]和20μg/ml考马斯亮蓝染料[VWR EM-3300]）的10厘米x 10厘米x 1.5厘米方形培养皿（LDP[Wayne,NJ]D210-16）中。对于生长在吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）上的生物膜制备，在高压灭菌后向菌落形态培养基中加入200μM PMS（Amresco[Solon,OH]0361）。对于硝酸盐实验，菌落形态培养基中加入0、10或40 mM硝酸钾。平板在25°C、>90%湿度（Percival[Perry,IA]CU-22L）下孵育长达5天，并使用VHX-1000数码显微镜（Keyence,Japan）每天成像。显示的图像代表了至少10个生物学重复。使用Keyence VR-3100大面积3D测量系统在第5天拍摄生物膜的3D图像。△cox△cyo△cio、hcn缺失突变体和用于硝酸盐实验的菌株使用平板扫描仪（Epson[Japan]E11000XL-GA）成像，代表了至少三个生物学重复。

TTC还原测定

将过夜培养物（五个生物学重复）点种1微升到含有0.001%（w/v）TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑[Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)T8877]）的1%胰蛋白胨、1.5%琼脂平板上，并在25°C黑暗中孵育24小时。使用扫描仪（Epson E11000XL-GA）对斑点进行成像，并使用Adobe Photoshop CS5（San Jose,CA）量化TTC还原情况（归一化至菌落面积）。无色的TTC在还原时经历不可逆的颜色变化变为红色。

液体培养生长试验

(i)在透明平底聚苯乙烯96孔板(VWR82050-716)中将隔夜前培养物以1:100稀释(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2以1:50稀释)，并培养两小时(OD500nm"0.2)。然后将这些培养物在新的96孔板中用1%胰蛋白胨稀释100倍，并在Synergy4平板阅读器的培养基设置下于37℃温度下连续振荡培养。在至少24小时内，每隔30分钟在500纳米处读取一次OD值来评估生长情况。(ii)hcn突变体：过夜前培养物以1:100稀释(ΔN1ΔN2Δhcn、ΔN1ΔN2ΔN4Δhcn和Δcco1cco2Δhcn稀释为1:50)，在MOPS最小培养基(50mM 4-morpholine-propanesulfonic acid(pH7.2)、43mM NaCl、93mM NH4Cl、2.2mM KH2PO4、1mM MgSO4·7H2O、1mg/ml FeSO4·7H2O、20mM六水合琥珀酸钠)中，培养2.5小时，直至500纳米波长处的OD值=0.1。然后将这些培养物在MOPS极少量培养基中稀释100倍，置于透明平底聚苯乙烯96孔板中，在37℃温度下培养，并在平板阅读器的培养基设置下持续振荡。在至少24小时内，每隔30分钟在500纳米处读取一次OD值，以评估生长情况。(iii)终止氧化酶报告物：过夜前培养物以生物三联培养；每个生物三联培养物以技术二联培养。过夜前培养物在1%胰蛋白胨中以1:100稀释，培养2.5小时，直到500纳米处的OD值为0.1。然后将这些培养物在1%胰蛋白胨中稀释100倍，装入透明平底黑色聚苯乙烯96孔板(VWR82050-756)中，在37℃温度下培养，并在平板阅读器的培养基设置下持续振荡。在24小时内，每小时分别在480纳米和510纳米的激发波长和发射波长下读取荧光值，以评估GFP的表达。在24小时内，每隔30分钟在500纳米波长处读取一次OD值，以评估生长情况。将技术复制的生长和RFU值取平均值，得出每个生物重复的相应值。没有在gfp基因上游插入启动子的菌株(MCS-gfp)的RFU值被视为背景值，并从每个报告基因的荧光值中减去。