摘要缺氧（hypoxia）是细菌在宿主定植过程中面临的常见挑战，部分原因是形成了密集聚集的群落（生物膜）。cbb3型细胞色素c氧化酶，催化呼吸作用的终末步骤并具有高氧亲和力，已被认为与细菌致病性相关。假单胞菌属不同寻常之处在于它们通常包含多个完整和部分（即“孤儿”）的cbb3型氧化酶和氧化酶亚基操纵子。在此，我们描述了孤儿催化亚基CcoN4在机会性病原体铜绿假单胞菌PA14菌株的菌落生物膜发育和呼吸作用中的独特作用。我们还发现，CcoN4有助于还原吩嗪（phenazines）——一种在生物膜中支持细胞氧化还原平衡的抗生素，并有助于在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）感染模型中的毒力。这些结果突显了菌落生物膜模型与致病性的相关性，并强调了cbb3型氧化酶作为治疗靶点的潜力。

引言

在可用于生物还原的氧化剂中，分子氧（O2）提供最高的自由能产量。自从O2在大约24亿年至5.4亿年前在大气中积累以来（Kirschvink and Kopp,2008;Dietrich et al.,2006b），能够利用它生长和生存并耐受其有害副产物的生物已经进化以利用这种能量并增加了复杂性（Knoll and Sperling,2014;Falkowski,2006）。在小尺度和拥挤的环境中，O2的快速消耗导致对该资源的竞争，并促进了细菌和古细菌的O2还原机制多样化，而这种多样化在真核生物中没有发生（Brochier-Armanet et al.,2009）。使细菌能够呼吸O2的各种酶表现出不同的亲和力和质子泵效率，并可能有助于在缺氧生态位中的竞争成功（Morris and Schmidt,2013）。此类环境包括被具有高度农业（Preisig et al.,1996）和临床（Way et al.,1999;Weingarten et al.,2008）重要性的细菌定植的动植物宿主组织。

机会性病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），一种能够定植于植物和动物宿主的细菌（Rahme et al.,1995），具有分支的呼吸链，具有使用五种经典的末端氧化酶复合物将O2还原为水的潜力：两种醌氧化酶（bo3（Cyo）和一种氰化物不敏感bd型氧化酶（CIO））和三种细胞色素c氧化酶（aa3（Cox）、cbb3-1（Cco1）和cbb3-2（Cco2））（图1A）。几篇关键出版物描述了铜绿假单胞菌的末端氧化酶补体，揭示了该生物特有的特征（Williams et al.,2007;Comolli and Donohue,2004;Alvarez-Ortega and Harwood,2007;Arai et al.,2014;Kawakami et al.,2010;Jo et al.,2014）。铜绿假单胞菌的不同寻常之处在于它编码两种属于cbb3型家族的氧化酶。这些酶以其在低O2浓度下相对较高的催化活性以及仅限于细菌域（Brochier-Armanet et al.,2009;Pitcher and Watmough,2004）而著称。（铜绿假单胞菌的cbb3型氧化酶通常被称为cbb3-1和cbb3-2；然而，我们将使用‘Cco1’和‘Cco2’来表示这些酶，与其编码基因的注释一致。）大多数编码cbb3型氧化酶的细菌基因组只包含一个此类复合物的操纵子，其在O2限制条件下特异性诱导（Cosseau and Batut,2004）。在铜绿假单胞菌中，cco2操纵子在低O2浓度生长期间被诱导，但cco1操纵子在高水平组成型表达（Comolli and Dono-hue,2004;Kawakami et al.,2010）。

图1铜绿假单胞菌的呼吸链和cco基因及蛋白产物的排列，以及ccoN孤儿基因的系统发育分布。(A)铜绿假单胞菌的分支电子传递链，包含五个典型的末端氧化酶。(B)cco基因在铜绿假单胞菌基因组中的组织结构。Cco复合物的图解基于P.stutzeri的Cco结构(PDB：3mk7)。(C)左图：各细菌门中含有ccoO和N同源物的基因组比例示意图。由于Chrysiogenetes、Gemmatimonadetes和Zetaproteobacteria支系中只有一个物种含有ccoO和N同源物，因此省略了这些支系。

铜绿假单胞菌末端氧化酶补体的另一个奇特之处在于，在染色体上远离cco1和cco2操纵子的位置存在编码“孤儿”cbb3型亚基的基因。虽然染色体相邻的cco1和cco2操纵子各自包含四个编码功能性Cco复合物（由N、O、P和Q亚基组成）的基因，但另外两个部分操纵子ccoN3Q3和ccoN4Q4各自仅包含编码Q和催化性N亚基的同源基因（图1B）。ccoN3Q3操纵子的表达在厌氧反硝化条件下被诱导（Alvarez-Ortega and Harwood,2007），并在2%O2下生长期间暴露于亚硝酸盐时被诱导（Hirai et al.,2016）。在液体培养物中需氧生长期间，ccoN4Q4被氰化物诱导，氰化物在稳定期产生（Hirai et al.,2016）。然而，额外的表达研究表明ccoN4Q4转录受氧化还原条件影响，因为该操纵子被O2限制诱导（Alvarez-Ortega and Harwood,2007）并在响应铜绿假单胞菌产生的氧化还原活性抗生素pyocyanin（绿脓菌素）时轻微下调（Dietrich et al.,2006a）。

在最近的一项研究中，Hirai等人表征了铜绿假单胞菌PAO1中含有经典亚基和孤儿亚基组合的cbb3异构体的生化特性和生理作用（Hirai et al.,2016）。在一个缺乏所有需氧末端氧化酶的菌株中，表达任何异构体都赋予利用O2生长的能力，证实含有孤儿N亚基的异构体具有功能。此外，作者发现，在低O2条件下的液体培养物生长期间，ccoN3Q3和ccoN4Q4的产物分别有助于对亚硝酸盐和氰化物的抗性。虽然这些结果为cbb3异质复合物在液体培养物生长中的作用提供了见解，但含N3和N4的异构体在生物膜生长和致病性中的潜在作用仍有待探索。

生物膜生活方式——细胞在自产基质包裹的密集群落中生长——已被认为与多种系统中感染的确立和持续存在有关（Edwards and Kjellerup,2012;Rybtke et al.,2015）。生物膜发育促进了O2梯度的形成，使得远离生物膜表面的细胞处于缺氧或无氧条件（Werner et al.,2004）。使用菌落形态分析来研究氧化还原代谢及其与群落行为的关系，我们发现生物膜中细胞的O2限制导致细胞内氧化还原状态失衡。这可以通过群落形态的改变来缓解，该改变增加了生物膜的表面积与体积比，从而增加了常驻细胞对O2的获取（Kempes et al.,2014）。对于生物膜中的铜绿假单胞菌细胞，还原力的细胞内积累也可以通过产生和还原内源性抗生素吩嗪来防止，吩嗪介导向远处可用的氧化剂的胞外电子转移（Dietrich et al.,2013）。我们发现生物膜特异性的吩嗪产生有助于急性肺感染小鼠模型中的致病性（Recinos et al.,2012），进一步说明了吩嗪介导的氧化还原平衡对于群落中铜绿假单胞菌细胞的重要性。

由于生物膜生活方式固有的O2梯度形成，我们假设铜绿假单胞菌cco操纵子的差异调节影响了它们对生物膜亚区代谢电子流的贡献。我们评估了各种cbb3型氧化酶异构体在多细胞行为和毒力中的作用。我们的结果表明，含有孤儿亚基CcoN4的异构体可以通过O2和吩嗪还原支持生物膜中的生存，并有助于铜绿假单胞菌在秀丽隐杆线虫“缓慢致死”感染模型中的致病性。