研究简介:乳腺癌是全球最常见的癌症之一，其治疗手段包括手术、放疗和系统化疗等。然而乳腺癌的预后仍面临挑战，尤其是对于发生转移的患者。乳腺癌组织抵御细胞内酸化的机制依赖于通过钠碳酸氢盐共转运蛋白NBCn1/Slc4a7和钠氢交换蛋白NHE1/Slc9a1的净酸排泄。NBCn1作为一种乳腺癌易感性蛋白和潜在的治疗靶点逐渐受到关注，而针对NHE1的靶向治疗效果尚不明确。目前已有针对NHE1的选择性小分子抑制剂，但针对NBCn1的抑制剂尚未出现。细胞实验结果表明，NHE1的活性与细胞增殖、迁移和侵袭相关，且NHE1表达的破坏可减少三阴性乳腺癌的生长。然而在人类乳腺癌组织中，高NHE1表达与降低的转移风险以及某些分子亚型中改善的患者生存率相关。研究人员通过三种不同的给药方式（饮水、渗透泵和肿瘤内/周围注射）对小鼠进行卡里柏利处理，以评估其对肿瘤生长的影响。实验测量了肿瘤体积、细胞内pH（pHi）、净酸排泄以及血清和组织间质中的代谢物水平等指标。本研究探讨了卡里柏利（Cariporide）对ErbB2驱动的乳腺癌生长的影响。卡里柏利是一种选择性钠氢交换蛋白1（NHE1）抑制剂，已知NHE1在乳腺癌细胞的酸化防御中起关键作用。研究使用FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J小鼠模型，该模型通过在乳腺上皮中过表达ErbB2来模拟人类乳腺癌的发生和发展。

Unisense微电极系统的应用

Unisense微电极被用于测量小鼠乳腺肿瘤组织的pH值。小鼠通过腹腔注射麻醉剂（如氯胺酮和甲苯噻嗪）进行麻醉，并放置在加热垫上以保持体温。通过小切口暴露肿瘤组织，将微电极安装在微操纵器上，微电极的参考电极放置在腹腔内。微电极以1毫米的步进逐渐插入肿瘤组织，记录每个位置的pH值。测试到肿瘤组织中最酸性位置的pH值。Unisense微电极精确测量了肿瘤组织内部的pH值，对于理解肿瘤微环境的酸碱状态至关重要。肿瘤微环境的酸碱状态与肿瘤的生长、侵袭和对治疗的反应密切相关。

实验结论

卡里柏利在体外能有效抑制乳腺癌组织的净酸排泄，但对稳态细胞内pH（pHi）的影响较小。长期体内给药卡里柏利通过上调钠碳酸氢盐共转运蛋白NBCn1的表达进行补偿，使pH调节更多地依赖于二氧化碳/碳酸氢盐（CO₂/HCO₃⁻）机制，因此对ErbB2驱动的乳腺癌生长没有明显的影响。卡里柏利在体外能有效抑制乳腺癌组织的净酸排泄并轻微降低细胞内pH，但在体内长期使用时，由于NBCn1的上调和pHi调节机制的改变，卡里柏利对ErbB2驱动的乳腺癌生长没有显著影响。这一发现表明，尽管NHE1是一个有前景的治疗靶点，但在实际应用中可能需要考虑其他补偿机制的影响。研究结果为NHE1抑制剂在乳腺癌治疗中的潜在应用提供了重要见解，并强调了在体内环境中评估药物效果的复杂性。

图1、卡里柏利抑制乳腺癌组织的净酸挤出，IC为0.18μM。A.从乳腺癌组织中分离并加载pH敏感荧光团BCECF的原代类器官的图像。B-E.在NH预脉冲实验期间从初级类器官测量的pH值的平均痕量（n=5-8）。卡里柏利以10μM施用。F.从乳腺癌组织和正常乳腺组织中急性分离的原代类器官的静息稳态pH，并在存在和不存在CO/HCO的情况下进行评估（n=7-8）。通过双向方差分析比较数据，然后进行ˇSíd'ak后测试。G，H.净酸挤出活性绘制为pH值的函数（n=7-8）。卡里柏利浓度为10μM。比较了基于最小二乘线性回归分析计算的曲线的截距和斜率。当暴露于不同浓度的卡立波利时，在没有CO/HCO的情况下，NH前脉冲诱导的酸化后，原发性乳腺癌类器官在平均pH值为6.8时评估的净酸挤出（n=7-9）。

图2、Cariporide略微降低乳腺癌组织中的稳态pH。A、B、D、E.从乳腺癌组织（A，B）或正常乳腺组织（D，E）中急性分离的pHin原代类器官的平均痕量。在存在（A，D）或不存在（B，E）CO/HCO的情况下施用卡立泊利（10μM），我们报告了与匹配的载体/时间对照（n=4）相比的pH值差异。C，F.在存在和不存在CO/HCO（n=4）的情况下，研究了从乳腺癌组织（C）和正常乳腺组织（F）分离的原代类器官中对10μM卡立泊利应用的pH反应，并相对于匹配的载体/时间对照进行了报告

图3、饮用水中提供的卡立泊利不会影响原发性乳腺癌的生长。A）在接受常规或含卡泊利的饮用水的小鼠的血清中测量的卡立泊利浓度。测试了来自4只对照小鼠（以确认测定特异性）和27只卡立泊利处理的小鼠的随机样本的血清。ND，检测不到。B）体内肿瘤体积测量（n=28）。显示最佳二阶多项式函数，并通过额外的平方和F检验进行比较;P值与对照。C）死后肿瘤切除后的离体肿瘤体积测量（n=28）。通过未配对的双尾学生t检验比较数据;P值与对照。D）图C的离体肿瘤体积绘制为相应测量的血清卡里泊利浓度的函数。

图4、通过渗透微型泵供应的卡立泊利不会影响原发性乳腺癌的生长。A)通过渗透微型泵（n=15-16）接受卡立波利或NaCl载体的小鼠血清中测量的卡立泊利浓度。ND，检测不到。B)体内肿瘤体积测量（n=24-25）。显示最佳二阶多项式函数，并通过额外的平方和F检验进行比较;P值与对照。C)死后肿瘤切除后的离体肿瘤体积测量（n=24-25）。D)图C的离体肿瘤体积绘制为图A中相应血清卡立普利浓度的函数。通过最小二乘线性回归分析比较数据

图5、口服但非肠外给药卡立泊利会升高血糖浓度。A、B、E、F.通过饮用水（A，B，n=10）或渗透微型泵（E，F，n=8–9）暴露于卡立泊利或载体的小鼠的血清葡萄糖（A，E，E）和乳酸（B，F）和乳酸（B，F）浓度。C、D、G、H.通过饮用水（C，D，n=10）或渗透微型泵（G，H，n=8–9）从暴露于卡立波利或载体的小鼠的乳腺癌和正常乳腺组织中通过微透析取样测量的间质葡萄糖（C，G）和乳酸（D，H）和乳酸（D，H）浓度。I.用pH敏感微电极（n=9–22）测量体内肿瘤pH值。面板A、B、E和F中的数据通过未配对的双尾学生t检验进行比较，在C、D、G和H中通过重复测量双向方差分析后跟ˇSíd'ak后测，在图I中通过单因素方差分析后跟Dunnett后测。P值与相同条件下的对照。

结论与展望

乳腺癌组织抵御细胞内酸化的机制依赖于通过钠碳酸氢盐共转运蛋白NBCn1/Slc4a7和钠氢交换蛋白NHE1/Slc9a1的净酸排泄。NBCn1作为一种乳腺癌易感性蛋白和潜在的治疗靶点逐渐受到关注，而针对NHE1的靶向治疗效果尚不明确。目前，已有针对NHE1的选择性小分子抑制剂，但针对NBCn1的抑制剂尚未出现。细胞实验结果表明，NHE1的活性与细胞增殖、迁移和侵袭相关，且NHE1表达的破坏可减少三阴性乳腺癌的生长。然而，在人类乳腺癌组织中，高NHE1表达与降低的转移风险以及某些分子亚型中改善的患者生存率相关。在此，我们评估了钠氢交换抑制剂卡里柏利/HOE-642在ErbB2驱动的乳腺癌小鼠模型中的治疗潜力。体外实验显示，卡里柏利可抑制乳腺癌组织的净酸排泄（IC50=0.18μM），并导致细胞内pH（pHi）的轻微下降。在体内实验中，研究人员通过口服、渗透泵以及肿瘤内和肿瘤周围注射的方式给药，以解决卡里柏利口服生物利用度低和代谢快的问题。

长期体内给药卡里柏利可上调NBCn1表达，使pHi调节更多地依赖于二氧化碳/碳酸氢盐机制，并且对ErbB2驱动的原发性乳腺癌的生长速率无净影响。卡里柏利也不会影响乳腺癌组织中的增殖标志物。口服卡里柏利会使血清葡萄糖水平升高约1.5 mM，而通过其他途径给药则不会。卡里柏利在体外可有效抑制乳腺癌组织的净酸排泄，但对稳态pHi的影响较小。长期体内给药卡里柏利通过NBCn1进行补偿，我们观察到对ErbB2驱动的乳腺癌生长没有明显的影响。unisense氢气微电极通过精确测量肿瘤组织内部的pH值，为评估卡里柏利对肿瘤微环境的影响提供了关键数据。这些数据支持了研究的主要结论，即卡里柏利在体内对ErbB2驱动的乳腺癌生长没有显著影响。