经2-DG处理的大鼠脑切片的病理变化

图3经2-DG处理的大鼠海马体外切片和组织样本的代谢和电参数变化。A：对长期接受2-DG处理的动物海马切片进行的体内外测量显示，与接受载体处理的动物切片相比，它们的神经元对葡萄糖剥夺的耐受性要差得多。B：在经2-DG处理的大鼠切片中(齿状回的通道记录)，Em没有变化(n=29，P>0.2)，而EGABA则显著去极化(P<0.01，n=20)。

对长期接受2-DG处理的动物海马切片进行的体内外测量显示，与接受药物处理的动物切片相比，它们的神经元对葡萄糖剥夺(低葡萄糖溶液，0.1mM)的耐受性要差得多(图3A)。2-DG组大鼠的eLFP积分衰减到50%的时间是经空白载体处理的大鼠的一半(约25分钟，n==11，与>70分钟，n=12；P<0.001)，这可能是因为糖原储存减少的缘故(图3C)。以前也曾使用类似的方案来确定糖原储备及其对神经元活动的支持。

图3 C：脑组织样本的核磁共振分析结果(对照组[载体]大鼠，n=5；2-DG大鼠，n=5)。N-AcAsp表示N-乙酰天冬氨酸。

在体外切片中对单个神经元(齿状回颗粒细胞)的测量也表明，虽然Em没有变化(-79.3±2.3和-82±2.4mV，n=29，P>0.2)，但在经2-DG处理的大鼠神经元中，EGABA明显去极化(-67.2±4.0 vs.-83.7±3.4mV，n=29，P<0.01；图3B)，这表明抑制性驱动力的效力大大降低。这可能是2-DG治疗期间网络过度兴奋性发展的一种细胞机制。

对2-DG处理过的大鼠脑样本进行核磁共振分析后发现，它们的脑能量储备(糖原和腺苷酸减少，腺苷增加)和线粒体代谢(琥珀酸减少)发生了显著的有害变化(图3C)。

讨论

我们的研究结果表明，慢性代谢低下是后天性癫痫的公认风险因素(如脑外伤、中风、病毒感染、癫痫状态)的特征，特别是葡萄糖利用率降低(通常在癫痫患者中观察到)，很容易引发癫痫。反过来，我们最近发现，癫痫发作本身会导致葡萄糖利用率快速而持久地下降，从而完成癫痫诱发和发展的恶性循环。我们提出，与氧化应激和神经炎症相关的能量供应不足是后天癫痫发生的诱因和驱动力。本研究的结果提供了与风险因素相关的脑能量代谢不足与癫痫发生之间缺失的联系。

关于癫痫治疗，我们的研究结果表明，长期抑制大脑能量代谢是一种危险的策略，因为这会进一步加剧癫痫发生过程中已经形成的代谢危机。这种对能量供应的抑制不太可能像有些人认为的那样，有助于观察到KD的抗癫痫作用，因为据报道，在KD期间ATP合成正常或增加，而脑组织中的ATP水平要么保持不变，要么增加。据报道，无论酮病或非酮病状态如何，KD期间葡萄糖的氧化能力都很高，尽管也发现脑葡萄糖代谢率降低。我们的结论是，在KD期间，由于酮体部分替代葡萄糖为线粒体提供燃料，糖酵解可能会有所减少；但这不应被视为能量代谢的全面抑制。

以前的研究曾试图通过在点燃程序之前立即静脉注射2-DG来抑制糖酵解，从而复制KD的抗癫痫效应。作者们的研究表明，在不同的点燃方法和2-DG剂量(75-500毫克/千克)下，点燃效率和由此导致的癫痫都会明显降低。然而，如果对血液和大脑中的2-DG浓度进行估算，就很难支持这一结论。一项在大鼠身上进行的研究显示，2-DG可预防缺血引起的死亡，该研究使用了1.6克/千克的静脉注射量，结果显示血液中的2-DG含量高达1.6毫摩尔。假设2-DG和葡萄糖通过血脑屏障的转运相似，且葡萄糖梯度为5:1(血液中6mM对大脑ECF中1.3mM)，则大脑中的2-DG浓度为0.32mM。这种计算方法可能在一定程度上低估了2-DG的水平，因为低ECF葡萄糖可能是通过有效的细胞消耗来维持的。然而，耐人寻味的是，注射2-DG还会导致血糖水平和脑血流量同时显著上升，这在动物和人类身上都有报道。这些因素应导致大脑ECF葡萄糖的相应增加。使用与我们的"方法"中相同的糖酵解抑制计算方法，并考虑到由此得出的脑2-DG和葡萄糖浓度，我们可以估计，即使使用用于抗癫痫治疗的最高2-DG剂量(500毫克/千克)，脑糖酵解抑制作用也只能达到约1%至2%，几乎可以忽略不计。因此，皮下注射2-DG更有可能是通过全身驱动效应来发挥抗癫痫作用的，例如上述脑葡萄糖供应量和脑血流量的短暂增加。在我们的活体实验中，脑室内注射2-DG所使用的浓度应能短暂抑制脑糖酵解约14%。这样的量级不太可能造成大规模的形态学破坏或细胞死亡，因此我们得出结论，是对脑糖酵解的直接和部分抑制导致了所观察到的癫痫表型。事实上，单次脑室内注射2-DG已被用于研究葡萄糖剥夺对大鼠摄食行为的影响，其浓度比我们的浓度高出10倍以上，这表明脑室内给药在脑细胞存活和糖酵解抑制方面是有效的。否则，鉴于2-DG治疗的慢性性质以及脑内给药方法，很难将我们的活体研究结果与之前的研究结果进行直接比较。

最近一项使用LDH阻断剂作为能量代谢抑制替代方法的研究报告称，该方法具有显著的急性抗惊厥效果。研究表明，通过腹腔注射或海马内注射LDH阻断剂抑制糖酵解，可迅速降低注射凯因酸盐的小鼠海马中的高压尖峰频率。作为LDH阻断剂作用的一种可能机制，作者提出LDH抑制会导致星形胶质细胞乳酸生成和释放受阻，从而造成神经元能量短缺，激活通过KATP通道的超极化电流，消除网络的过度兴奋性。

然而，该研究中的所有体外记录都是在室温和含有2.5毫摩尔葡萄糖的ACSF中进行的，作者认为这是一个"类似于体内"的浓度。同时，体外切片和体内的葡萄糖消耗量也大不相同。在切片中，由于静息状态下的大量消耗，组织内的基础葡萄糖浓度几乎是灌流液的一半(见图4A)。在突触激活过程中，细胞外葡萄糖和氧气水平会下降，并在刺激后缓慢恢复。相反，在活体大脑中，网络激活过程中消耗的葡萄糖和氧气会迅速从血管中补充回来(见图4B)。因此，在ACSF中含有2.5毫摩尔葡萄糖的情况下，切片组织中的葡萄糖浓度即使在静止时也只有约1毫摩尔，这当然是一种缺糖状态，而在突触刺激过程中葡萄糖浓度会进一步降低。

对体内结果的解释源于一个假设，即乳酸从星形胶质细胞单向流入神经元并被用作能量燃料。然而，我们在切片和体内对乳酸释放的记录并没有显示网络激活引起大量乳酸消耗的迹象--恰恰相反，我们记录到的是大量乳酸释放(见图4)。尽管乳酸肯定可以用作能量来源，但在正常情况下，神经元中的部分丙酮酸似乎会被LDH转化为乳酸并释放到细胞外空间。如果是这样的话，那么阻断LDH确实可能会通过丙酮酸诱导的糖酵解抑制而导致严重的能量剥夺。例如，Sada等人的研究表明，抑制LDH会导致兴奋性突触后电流减少70%，这很可能是由于突触递质释放减少所致(因为突触后靶细胞是在细胞内溶液中含有4mMATP的全细胞构型下记录的，这就避免了LDH受阻导致的能量短缺)。突触前机制可能主要依赖于糖酵解提供的ATP，因此报告的LDH效应很可能是突触前糖酵解抑制的结果。因此，与2-DG的急性效应类似，能量剥夺引起的最初网络活动减少也会导致短期抗癫痫效应，尽管不能排除相反的癫痫发作效应。我们的结果还表明(见图1A)，能量缺乏可能会导致双向效应，这取决于诱发的突触传递下调与Em和EGABA去极化之间的平衡。

总之，这项研究的结果支持了我们关于后天性癫痫是一种代谢性疾病的概念观点，突出了抑制脑能量代谢作为一种治疗策略的风险。