结果

急性糖酵解抑制引起的神经元参数变化

图1抑制海马体切片糖酵解时的代谢和电参数。A：a)在CA1区，2-DG(7mM 15mM葡萄糖，抑制糖酵解约35%)降低了刺激Schaffer支脉诱发的eLFPs(施加2-DG后40分钟)。然而，在一个切片中，eLFPs没有减少，并显示出多个次级尖峰(见插图)，表明网络兴奋性过高；b)2-DG减少了CA1(n=6，P<0.001)和齿状回(n=4，P<0.03)；=(c)2-DG引起静息膜电位(Em；n=8，P＜0.01)和GABA介导的电流反转电位(EGABA；n=6，P＜0.05)的去极化。B：2-DG还降低了CA1(n=6，P＜0.001)和齿状回(n=4，P＜0.03)对突触刺激(10Hz，10秒)反应的(a)(b)NAD(P)H瞬态和(c)骤降/过冲比显著增加，与糖酵解受抑制一致。C：2-DG能明显降低突触刺激时的耗氧量。D：a)0.1mM 2,4-二硝基酚(DNP)抑制线粒体呼吸诱导静息膜电位(Em；n=9，P<0.01)和EGABA(n=8，P<0.001)，通过单个NMDA和GABA受体通道的细胞附着贴片记录测量L2/3锥体细胞；b)将ACSF葡萄糖浓度降至0.2mM(n=6，Em和EGABA分别为P<0.05和0.01)也可获得类似的效果。两种情况下细胞内ATP浓度的降低程度相似。

在海马切片中，施用7mM 2-DG会诱发CA1和齿状回层的局部场电位(eLFPs)(图1Aa)逐渐降低(分别降低了49%±5%，n=6，P<0.01和25%±6%，n=4，P<0.03；图1Ab)。

然而，在一个CA1切片中，eLFPs没有减少，反而在2-DG作用下表现出多个次级群体尖峰，这表明网络亢奋(见图1Aa插图)。此外，重复性突触刺激(10赫兹，10秒)显示了2-DG对网络反应的不规则影响，eLFP总积分在对照组的114%和42%之间变化(平均值为76±12，n=6，P=0.099)。同时，在齿状回颗粒细胞中，使用桔皮素穿孔贴片技术测量2-DG应用1小时后，2-DG诱导了Em(从-87.6±2.3到-73.3±1.5mV，n=8，P＜0.01)和EGABA(从-85.8±3.1到-76.6±2mV，n=6，P＜0.05)的显著去极化。这些效应并非2-DG所特有，可以通过其他抑制能量代谢的方法再现，如将ACSF葡萄糖浓度降至0.2mM或使用氧化磷酸化抑制剂二硝基苯酚(0.1mM)(图1D，单通道记录)。

在CA1和齿状回中，2-DG改变了NAD(P)H在重复性突触刺激(10赫兹，10秒，图1Ba、b)下的自发荧光瞬态："浸润"(氧化)和"过冲"(还原)两种瞬态成分的振幅都减小了，而NAD(P)H的浸润/过冲比值显著增加(图1Bc；CA1和DG信号分别为n=6，P<0.001和n=4，P<0.03)，这证实糖酵解受到了抑制。2-DG也显著降低了刺激诱导的CA1耗氧量(图1C)。NAD(P)H荧光和耗氧量的减少可能并不是因为网络对刺激的反应受到抑制，因为所有实验中都观察到了这两个参数的减少，甚至那些应用2-DG后整体反应(训练eLFP积分)增加的实验也是如此。

因此，在切片中对糖酵解的急性抑制可使神经元去极化并降低GABA能抑制，从而提高突触后兴奋性，但同时也可能降低兴奋性突触传递的功效。据推测，2-DG对神经网络兴奋性的这些相反作用可以调和在体内报告的2-DG促冲动和抗惊厥急性效应。

慢性糖酵解抑制引发体内癫痫发生

图2长期抑制脑糖酵解会诱发大鼠癫痫。在自由活动的大鼠中，每天静脉注射2-DG会导致阵发性活动的发生。A：一只大鼠在2-DG处理前(蓝色迹线)和处理后(红色迹线)的代表性LFP记录；插图(箭头)清楚地显示了静止期振荡活动的差异。B：a)A中所示LFP记录的功率谱密度(PSD)；b)在记录过程中导致一只大鼠死亡的强直阵挛发作的例子。

为了研究2-DG在体内的长期影响，我们记录了自由活动的大鼠在通过每天静脉注射2-DG直接抑制脑糖酵解(10只大鼠接受2-DG治疗，8只大鼠接受空白对照治疗)前后的脑部活动。在2-DG治疗4周后，我们在2只大鼠中检测到了密集的自发性癫痫发作活动(平均次数分别为42.3次/小时和26.6次/小时，平均持续时间分别为57.9秒和38.6秒)，而在其他2-DG治疗大鼠或空白对照大鼠中均未检测到癫痫发作活动。图2A显示了这两只大鼠中的一只在2-DG治疗4周前后记录到的代表性LFP。插图显示了短时间的"静止"基线活动，在治疗前(左图)存在明显的θ节律振荡，而在2-DG治疗后(右图)这种活动被完全破坏。事实上，服用2-DG后，低频(以及主导频率的转换)和高频的信号功率都显著增加(图2Ba)。

图2 C：注射35毫克/千克PTZ后测量2-DG/空白处理前(蓝色/黑色迹线)和处理后(红色/灰色迹线)的平均癫痫严重程度。D：各组大鼠在治疗前后的平均功率谱密度(均归一化为总PSD积分)(2-DG组10只，空白载体组5只)。在Δ频率范围(1-4Hz)，PSD峰值在2-DG作用下明显变小。E：2-DG治疗强烈增加了各组所有大鼠的平均累积活动。F：2-DG治疗增加了LFP高振幅尖峰(尖波，在50至990毫秒时间范围内测量)和(G)高频爆发(HFBs；在100至250赫兹范围内测量；详见方法)的数量。

经2-DG处理的无自发性癫痫发作的大鼠(n=8)也表现出神经元网络活动异常。如图2D所示，经归一化处理的平均PSD(所有大鼠；每只大鼠的PSD均归一化为总PSD积分)显示，经2-DG处理的大鼠在Δ范围频率(1-4Hz)的功率显著降低。此外，这些动物还表现出一种过度活跃的网络状态，表现为"超基底"活动的显著增加，即振幅超过基底水平的信号。此类事件可能由不同类型的生理或病理活动触发，其累积水平可作为网络兴奋性的衡量标准。我们计算了所有LFP记录中连续20秒的累积活动(见方法)，并对各组大鼠的累积活动进行了平均(图2E)，结果发现2-DG处理后LFP累积活动显著增加，表明诱发的阵发性活动水平很高。处理还导致高振幅尖峰的数量显著增加(从每10分钟记录10.9±4.0到29.2±12.8，n=10；P<0.02；图2F)。此外，2-DG还能诱导产生在60至250Hz频率范围内检测到的多个高频尖峰(从每10分钟记录4.2±1.9到32±14.5，n=10；P<0.01；图2G；参见"方法"中的"LFP分析")。癫痫患者和动物癫痫模型的脑电图中都曾出现过HFBs，它们被认为反映了与癫痫发生相应的病理活动。PTZ癫痫发作试验(评估神经组织兴奋性的变化)显示，2-DG处理的大鼠癫痫发作阈值降低(图2C)。共有三只经2-DG处理的大鼠死亡，其中一只是因为在记录过程中强直-阵挛发作(图2Bb)，另外两只是在夜间死亡(可能也是由于癫痫发作)。这些事件以及记录的参数和分析有力地证明，2-DG确实会诱发网络过度兴奋，导致自发性癫痫发作。

总之，这些结果清楚地表明，长期抑制糖酵解会导致类似癫痫发生的神经网络异常状态。