体内实验

大鼠的慢性脑葡萄糖代谢不足。研究在两组大鼠身上进行：对照组(n=16)和每天静脉注射2-DG 1个月后出现慢性脑葡萄糖代谢低下的大鼠(n=21)。2-DG是一种合成的葡萄糖类似物，可与葡萄糖竞争，通过载体介导运输进入哺乳动物大脑。它还能竞争性地磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，后者不能被磷酸葡萄糖异构酶转化为6-磷酸果糖，从而抑制糖酵解。直接向大脑注射2-DG会在没有全身性低血糖的情况下产生局部细胞葡萄糖减少症，并排除糖酵解抑制对其他器官的潜在负面影响。我们在脑室内注射了2.5μl的2-DG溶液(20mM)(8.2微克)。脑脊液的总体积约为90μl，假定脑脊液中的2-DG扩散速度很快(部分由附膜细胞的纤毛促进)，2-DG的最终浓度为0.56毫摩尔，分布均匀。由于2-DG在大鼠大脑中通过细胞外液(ECF)传输到细胞的体积仅为1μl，因此我们可以假设最终ECF中的2-DG浓度也将等于0.56毫摩尔。成年大鼠海马的ECF葡萄糖浓度约为1.3mM。2-DG和葡萄糖共享相同的膜运输系统，但糖酵解速率的限制因素是己糖激酶的活性。相对糖酵解率可按下式计算：

U=Umax[Glu]/([Glu]+Km(1+[2-DG]/Ki)

葡萄糖磷酸化的迈克尔常数(Km)为0.07mM，2-DG的抑制常数(Ki)为0.3mM。因此，注射2.5微升20mM 2-DG溶液会导致糖酵解抑制率达到14%。动物以注射0.9%NaCl溶液(2.5微升)作为对照。

静脉注射药物4周后，一组大鼠用于LFP记录和随后的核磁共振分析，另一组大鼠用于戊四唑(PTZ)测试和体内外实验。在体外实验中，在最后一次注射2-DG/vehicle约12小时后提取大脑。

立体定向手术。大鼠在佐莱地尔(24毫克/千克，i.m.)和赛拉嗪(12毫克/千克，i.m.)的静注麻醉下进行手术。使用汉密尔顿注射器进行静脉注射给药时，将导管浸入侧脑室(AP=-0.8；L=1.0；H=3.0)。为了记录海马LFPs，在同侧海马前部齿状回区域(AP=-3.6；L=2.0；H=3.6)植入了100微米薄镍铬绝缘电极。参比电极被拧入枕骨。实验开始时间不早于术后一周。用于体外实验(n=8)和PTZ试验(n=12)的动物只植入了导引插管。

LFP记录。自由移动大鼠的LFP被放大、滤波(高通滤波器0.1Hz，数字化频率5kHz)，并使用DataPack2k软件(RUN Technologies)进行存储。实验方案：在几天的对照期内记录LFPs，然后每天服用药物或2-DG。每只大鼠每3天记录一次。在整个给药期间都记录LFPs。

所有记录均在清醒、自由活动的动物中进行，这些动物被关在自己的笼子里(以尽量减少状态变化带来的压力)，并被放置在法拉第笼中。每次记录之前，动物都要经过15分钟的实验条件适应期。记录时间为10：00至15：00。每次实验的平均持续时间约为2.5小时。在记录过程中，对动物进行监测和控制，使其保持清醒。进一步分析表明，在不同行为状态下(如躺卧或漫步)记录的LFPs没有明显差异。这种无差异可能是由于环境因素造成的，例如完全没有外部刺激(熟悉的小围栏、孤独、统一的背景、缺乏食物/饮料、一天中不活动的时间)。因此，在各种行为状态下记录的LFPs都集中在一起进行分析。随后，将大脑在液氮中快速冷冻，用于核磁共振分析。

LFP分析。为了评估高振幅尖峰的数量和持续时间，记录的标准偏差(SD)是从远离刺激区域的足够长的基础活动期(>3分钟)中计算出来的。程序扫描踪迹，在50至990毫秒的持续时间范围内选择所有高于等于5 SD的阈值水平的事件。

为了评估超过基础水平的LFP活动(累积活动)，我们采用了以下步骤：将LFP记录归一化为SD，并将阈值设为3 SD。程序扫描踪迹并选择所有高于阈值水平的事件。所有负事件均被反转。之后，程序计算每个连续时间段内的事件峰值总和。由于LFP记录已归一化，因此可对每组动物的累积活动进行平均。

为了比较高频猝发(HFB)事件，该算法扫描了在60到600Hz范围内过滤的LFP记录，并选择了所有超过7 RMS(基线均方根)阈值的事件。从这些事件中，进一步分析在100至250Hz和250至600Hz滤波迹线中超过7 RMS阈值的事件。只有由五个以上振荡组成的事件才会被考虑进行分析。以前也曾使用过类似的程序。为了检测和评估自发性癫痫发作，我们使用计算机自动分析LFP记录，其选择限制如下：癫痫发作阈值为基线的7 RMS；扫描窗口(5秒)中超过阈值的振荡次数不少于10；最短癫痫发作持续时间为10秒。

PTZ敏感性测试。为了研究动物对亚惊厥剂量的PTZ(35毫克/千克)的敏感性，我们将动物分为两组，分别是经空白载体处理的动物(n=6)和经2-DG处理的动物(n=6)。最初，在手术和慢性手术前注射PTZ以测试对照组的反应。在静注2-DG(或对照用载体)治疗4周后，再次注射亚惊厥PTZ。在最后一次注射2-DG/空白载体24小时后进行PTZ测试。根据W.Fischer和H.Kittner的研究，根据行为模式对癫痫发作严重程度进行评估。Kittner的研究：无发作(0期)；微弱点头(0.5期)；耳朵、脸部和眼睑抽搐(1期)；轻度前肢阵挛(1.5期)；肌阵挛性身体抽搐，前肢阵挛性抽搐(无后仰)(2期)；部分后仰和前肢快速阵挛性发作(2.5)；强力双侧前肢阵挛，伴有完全仰卧(10秒)(第3期)；仰卧和跌倒，伴有强力双侧前肢阵挛(第3.5期)；全身阵挛性发作，伴有仰卧-跌倒发作或跳跃(第4期)；全身阵挛-强直发作，伴有右侧反射失败(第4.5期)；全身阵挛-强直发作和癫痫状态(2分钟)(第5期)。

通过核磁共振测量脑代谢物。大鼠的整个头部在断头后被冷冻在液氮中。众所周知，这种技术能保留部分而非全部易变代谢物，但由于断头后的易变代谢物水平取决于自溶而非神经元兴奋性，因此检测到的变化仍能可靠地与已发展的病理状态相关联。

完全冷冻后，在-15℃温度下放置1小时，然后提取、破碎大脑并保存在液氮中。在冷冻样本中加入等重量的氯仿(CDCl3)和700微升D2O，在振动器中用玻璃球匀浆30秒，然后在15000g转速下离心5分钟。在540μl上清液中加入60微升4μM的3三甲基硅基[2,2,3,3-2H4]丙酸酯(TSP)D2O溶液，搅拌后放入NMR管中。1D和2D COSY图谱是在一台AVANCE III 600 NMR光谱仪上记录的，该光谱仪使用标准脉冲序列，质子频率为600MHz，管径为5毫米，温度为298°K。通过使用ZGPR 1D脉冲序列进行预饱和，实现了水抑制。采集次数为128次扫描，扫描间隔为10秒，足以满足所有观察到的代谢物的质子弛豫。在3.41秒内对96个K点进行了自由诱导衰变登记，光谱宽度为24ppm，90°脉冲为11μsec，并在填充零点后对128个K点进行了傅里叶变换。化学位移的校准是以0.00ppm的TSP信号作为内部参考。二维COSY序列COSYGPPRQF被用于细化峰值分配。利用布鲁克公司"AMIX"软件的光谱数据库以及公共数据库HMDB(人类代谢组数据库)对核磁共振光谱中的所有重要信号进行了识别，并将其分配给代谢物。针对核磁共振光谱中最重要的信号，计算了大鼠大脑中代谢物的相对浓度(即总可溶性化合物的分数)。为便于展示，将每种代谢物浓度归一化为个体最小值与最大值之差(%max-min)，并绘制成组均值±SEM。光谱处理和积分计算由布鲁克公司的"TOPSPIN"程序进行。