摘要

在致痫组织中发现的代谢异常提供了大量脑代谢不足的证据，而获得性癫痫的主要风险因素都以脑代谢不足为共同结果，这表明脑能量平衡的破坏实际上可能先于癫痫的发生。然而，脑能量代谢不足与癫痫发病之间的因果关系尚未确立。为了解决这个问题，我们通过每天脑室内注射不可代谢的葡萄糖类似物2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，建立了一个慢性能量代谢低下的体内模型，并研究了2-DG对细胞水平的急性影响。在海马切片中，2-DG的急性糖酵解抑制(约35%)会对网络产生截然不同的影响：兴奋性突触传递下调，神经元静息电位去极化，抑制性传递驱动力下降。因此，2-DG对神经网络兴奋性的潜在急性效应取决于突触前后这些对立变化之间的平衡。在体内，我们发现在最初健康的雄性大鼠中，长期静脉注射2-DG(估计对脑糖酵解的瞬时抑制率为14%)4周后会诱发癫痫样活动。我们的研究结果表明，大脑能量代谢的长期抑制是后天性癫痫风险因素的特征，特别是葡萄糖利用率的降低(通常在癫痫患者中观察到)可以启动癫痫的发生。

意义

后天性癫痫发病的确切机制尚未完全明了。目前已发现多种风险因素，如脑外伤、感染和中风，所有这些因素都会导致脑代谢不足。同时，在癫痫患者中也观察到葡萄糖消耗不足。我们发现，长期抑制健康大鼠大脑的葡萄糖消耗会导致癫痫。我们的研究结果表明，脑代谢不足不仅仅是疾病的副作用，而是后天癫痫的主要诱发因素。

引言

能量代谢紊乱与癫痫发生的关系已被广泛接受，但能量产生过程与神经元过度活跃之间的确切机理联系和因果关系仍在研究之中。重要的是，代谢不足(在人类中表现为脑部葡萄糖消耗减少)是后天性癫痫的一个主要因素。然而，一种流行的研究趋势认为，抑制能量代谢可能会产生有利的抗癫痫效果。这种想法主要基于低碳水化合物、高脂肪生酮饮食(KD)的效果，这是临床上唯一接受的治疗难治性小儿癫痫的代谢干预方法；KD用酮体部分替代葡萄糖作为线粒体燃料的一个推测结果是抑制糖酵解，因此许多试图复制KD核心治疗效果的研究特别关注糖酵解抑制的潜在抗癫痫作用。例如，据报道，服用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)或乳酸脱氢酶抑制剂可产生急性抗癫痫作用。然而，慢性糖酵解停滞是否会复制这些结果尚未得到阐明。与此同时，在致痫组织中发现的代谢异常提供了大量脑代谢低下的证据，并表明脑能量平衡的破坏实际上可能先于癫痫的发生。因此，试图抑制脑糖酵解存在潜在危险，因为这可能只会进一步加剧现有的代谢危机。必须解决的重要问题是脑代谢不足与癫痫发生之间的因果关系--换句话说，能量危机本身是否是癫痫发生的启动和驱动因素，还是仅仅是过度活动的结果。为了解决这个问题，我们开发了一种体内慢性能量代谢低下模型，每天脑室内注射2-DG。我们发现，在最初健康的大鼠体内长期注射2-DG会诱发癫痫样活动，这表明抑制脑糖酵解是癫痫的诱发因素，并突出了此类治疗策略的风险。

材料与方法

动物

九只OF1雄性小鼠用于脑切片急性实验。对37只成年Sprague-Dawley雄性大鼠进行了慢性实验。实验开始时，小鼠体重约为30至40克，大鼠体重约为220克。动物被饲养在单独的笼子里，光/暗周期为12：12小时，食物和水自由供应。所有实验均在10：00至15：00之间进行。在整个试验过程中都会监测动物的体重。

切片实验

脑切片准备。迅速将大脑从头骨中取出，放入冰冷的ACSF中。ACSF溶液包括(以毫摩尔为单位)NaCl 126、KCl 3.50、NaH2PO4 1.25、NaHCO3 25、CaCl2 2.00、MgCl2 1.30和葡萄糖5，pH值为7.4。ACSF用95%O2/5%CO2混合气体充气。使用组织切片机切割矢状切片(350μm)。切片过程中，切片浸没在冰冷(<6℃)的溶液中，溶液成分为(以毫摩尔计)K-葡萄糖酸140、HEPES 10、Nagluconate 15、EGTA 0.2、NaCl 4，pH值用KOH调节至7.2。切片被立即转移到一个不断循环ACSF的多节双侧灌注保温箱中，并在室温(22℃-24℃)下恢复2小时。

单细胞电生理学(Em和EGABA测量)。对于细胞附着单通道记录：NMDA受体电流的反向电位接近0mV；因此，在细胞附着记录中，测量NMDA电流的反向电位可得出静息膜电位(Em)的值。同时，GABA受体电流反向电位的测量提供了GABA诱导电流的驱动力。单通道记录使用含有(以毫摩尔为单位)(1)的移液管溶液进行，以记录单个GABA通道：NaCl 140、KCl 2.5、CaCl2 2、MgCl2 1、HEPES 10、GABA 0.01，pH值用NaOH调节至7.3；(2)用于记录单个NMDA通道：NaCl 140，KCl 2.5，CaCl2 2，HEPES 10，NMDA 0.01，甘氨酸0.01，用NaOH调节pH值至7.3。在急性期(无知觉动物)应用2-DG的情况下，切片在含有5mM葡萄糖和7mM 2-DG的ACSF中的蒸汽界面保持室中培养至少1小时，然后转移到灌注相同溶液的浸没式记录室中。在5mM葡萄糖存在的情况下，7mM 2-DG应能抑制约35%的葡萄糖转运进入细胞；对照组切片自始至终保持在5mM葡萄糖ACSF中。然后，按照之前的描述，在局部施加GABA脉冲的情况下，通过gramicidin-patch记录测量GABA介导的电流(EGABA)的电位和反向电位。

突触刺激和场电位记录。使用带有双极金属电极的DS2A隔离刺激器刺激Schaffer侧支/神经丛或穿孔路径。使用单脉冲(40-170μA，200μsec，0.15赫兹)调节刺激电流，以诱发约50%最大振幅的局部场电位(LFP)。用玻璃微电极记录LFP，微电极中注入ACSF，置于金字塔层或颗粒细胞层，并连接至ISODAM-8A放大器。在进行对照记录后，在添加2-DG 40分钟后记录LFPs。突触刺激包括以10Hz频率持续10秒的刺激序列(200微秒脉冲)。在低葡萄糖反应衰减实验中，用10mM葡萄糖ACSF灌注切片，并以10秒的间隔用恒定电流刺激(0.2毫秒，最高0.3毫安)发出测试脉冲，诱发相当于最大反应50%的LFP反应。在记录至少10分钟的稳定基线后，用改良的0.1mM葡萄糖ACSF诱导切片进行葡萄糖剥夺至少60分钟。测量诱发的LFP响应积分，并与基线值归一化。

NAD(P)H荧光成像。NADPH和NADH具有相似的光学特性；因此，预计NADPH可能会对总的自发荧光信号有所贡献。使用290-370纳米的激发滤光片和420纳米的长通滤光片监测海马切片中NAD(P)H荧光的变化。光源是配备汞弧灯的Intensiligh C-HGFI照明器。切片通过尼康直立显微镜(配备4×/0.10尼康物镜)进行外延照明和成像。使用线性冷却型12位CCD相机采集图像，数字空间分辨率为640×480。由于荧光发射水平较低，NAD(P)H或FAD图像以8×8分档图像的形式每600至800毫秒采集一次(有效空间分辨率为80×60像素)。对曝光时间进行调整，以获得介于2000至3000光强水平(动态范围的50%)之间的基线荧光强度。使用ImageJ软件(NIH)测量LFP和pO2记录点附近三至五个感兴趣区的辐射层荧光强度变化。数据以荧光相对于基线变化的百分比[(ΔF/F)100]表示。由于不同实验的荧光强度不同，因此使用氧化与还原(浸透-过冲)比率来平均和确定2-DG的能量代谢效应。

氧气、葡萄糖和乳酸盐测量。使用克拉克式氧微电极(尖端直径10微米；Unisense)测量切片组织的pO2，电极连接到皮米计(Unisense)上。组织葡萄糖和乳酸浓度用酶微电极(尖端直径25微米)测量。第一次极化后进行校准，每次实验后重复校准。在分析中，耗氧量按低于基线的pO2瞬态积分估算。