图5生物过程基因本体注释分析与电子传递链和TCA循环途径。A，与生物过程相关的基因本体注释分析的二维气泡图。图中显示了主要生物过程(圆圈)与外泌体中发现的蛋白质经FDR校正后的-Log10P值的对比图。圆圈的大小和颜色与每个生物过程相关蛋白质的数量成正比。B，在电子传递链和TCA循环途径中，用红色标出外泌体中富集的该生物过程的蛋白质，用浅灰色标出在文献尿液外泌体中发现的蛋白质。

在外泌体中发现的蛋白质具有特定的多样性，这可能意味着这些蛋白质具有不同的功能。为了评估这一点，我们使用细胞图谱软件进行了基于生物过程注释的基因本体分析。外泌体的生物过程中至少有20%的相关基因，且经FDR校正后P≤0.05的值被认为是显著的。基因本体分析确定了384个重要的顶级基因特征(数据未显示)。图5显示了生物过程基因本体注释分析的二维气泡图，突出显示了尿液外泌体中存在的主要生物过程。这些过程包括：运输、免疫系统过程、细胞分化、细胞运动、细胞粘附、细胞骨架组织、囊泡运输、细胞凋亡调控、蛋白水解、组织相关miRNA含量和新陈代谢。事实上，有趣的是，大多数基因名称特征与氧化代谢有关，其中葡萄糖代谢显著丰富，从而包括TCA循环和呼吸电子链(图5A)。特别是，TCA循环酶(ACO2是唯一的例外)和103个呼吸链蛋白中有34个被鉴定出来。尽管如此，如图5B所示，这34个蛋白质代表了所有五种呼吸链复合物。

图6尿液外泌体的耗氧量和ATP合成。A显示了尿液外泌体中氧气消耗。加入0.7mM NADH可刺激由复合物I、III和IV形成的途径。为了抑制这一途径，加入了40μM的鱼藤酮(复合物I的抑制剂)。然后，为了诱导由复合物II、III和IV组成的途径，加入20mM丁二酸，并使用50μM抗霉素A(复合物III的抑制剂)来停止反应。耗氧量以μM O2表示。B是与NADH或琥珀酸的耗氧量比较。数据以nmol O/min/mg表示。

这些意想不到的发现表明，尿液外泌体特别富含有氧代谢蛋白质，因此我们开始评估这些蛋白质在氧化磷酸化(OXPHOS)过程中是否活跃。为了评估这一点，我们评估了尿液外泌体的耗氧量和ATP合成。实验是在没有去污剂的情况下进行的，以检测表面的OXPHOS。图6A显示了尿液外泌体呼吸作用图，在加入NADH诱导由复合物I、III和IV组成的呼吸途径，或加入琥珀酸激活由复合物II、III和IV组成的呼吸途径之后，尿液外泌体的呼吸作用发生了变化。之所以选择NADH作为呼吸底物，是因为它有助于区分线粒体呼吸和线粒体外呼吸(我们之前已经证明了这一点)，因为它对作为呼吸底物的离体线粒体无渗透性。图6A显示，尿液外泌体消耗氧气的方式分别受到复合体I和III抑制剂鱼藤酮和抗霉素A的抑制。有趣的是，存在琥珀酸时的呼吸速率高于存在NADH时的呼吸速率，这也如图6B所示。这证实了耗氧量不是由于线粒体污染造成的，因为在这些细胞器中，复合体I、III和IV的途径通常比复合体II、III和IV组成的途径更有效。为了评估尿液外泌体中的耗氧量是否最终转化为ATP合成，我们在NADH存在下检测了ATP合成活性。ATP合成在反应的前2分钟呈线性(数据未显示)。P/O比约为2.4±0.3，表明氧消耗与ATP合成相关联。

图7外泌体蛋白质二维电泳图谱。A，外泌体总蛋白的代表性银染色；B，生物素化的外泌体表面蛋白；C，ATP5B的Western印迹检测。用抗ATP5B检测FoF1-ATP合酶beta亚基后观察到的斑点与观察生物素化外泌体蛋白后观察到的一些斑点重叠，表明这些斑点代表了外泌体表面特异表达的一种蛋白。

为了证实呼吸电子链复合物在外泌体表面表达，我们使用EZ-linksulfo-NHS-LC-LC生物素酯对膜表面蛋白进行化学共轭，并对呼吸电子链复合物中的一个蛋白即ATP合成酶β亚基(ATP5B)进行了免疫检测。EZlinksulfo-NHS-LC-LC生物素酯是一种细胞渗透性氨基反应剂，广泛用于标记暴露在活细胞表面的蛋白质。此外，生物素与中性印迹蛋白的结合是已知最强的非共价相互作用之一，是使用HRP结合物中性印迹蛋白特异性检测生物素化蛋白质的有力工具。因此，只有那些暴露在表面并被生物素标记的蛋白质才会被揭示出来。在这里，生物素化的外泌体被裂解并通过二维凝胶电泳(2-DE)分离。将等量的裂解液转移到硝酸纤维素膜上，用HRP连接的中性葡萄蛋白检测，并与银染色的相同裂解液进行比较。通过比较总蛋白图谱(图7A)和生物素化蛋白图谱(图7B)，可以发现蛋白质的数量和组成存在很大差异。这一结果与外泌体表面蛋白生物素化的高度特异性是一致的。

此外，在检测抗-ATP5B后获得的同一裂解液图像(图7C)中也出现了一个斑点，其位置与生物素化外泌体蛋白可视化后观察到的位置相同，这表明这些斑点代表了特异性存在于外泌体表面的蛋白质种类。

4讨论

测定健康尿液的蛋白质组成可加深对肾脏生理的了解，并建立一个数据库，用于比较正常尿液和各种肾脏疾病患者的尿液。在本研究中，为了进一步加深对健康尿液蛋白质组的了解，我们使用了12份尿液样本来鉴定水溶性尿瘤(2473个蛋白质)和外泌体(1951个蛋白质)的蛋白质组成。采用的方法是顺序取样法，这种方法可以生成尿液蛋白质组图谱，该图谱由子馏分构建，突出了具有不同化学物理特性的蛋白质，如高度疏水性蛋白质(沉淀馏分)、微弱蛋白质(珠子馏分)和来自不同纳米囊泡的蛋白质(外泌体馏分)。这样还可以将尿瘤体与其外泌体进行比较。尽管样品制备技术需要更多的工作和时间，但CPLL-bead处理方法发现了大部分新鉴定的蛋白质，证实了发现阶段的实用性，有助于生成健康的尿液蛋白质数据库。

为了更好地了解两种样本之间蛋白质表达的差异，我们将尿液收集对象限定为年龄在35-45岁之间的健康捐献者，从而减少了生物变异；由于尿液蛋白质组会随时间发生明显变化，我们还收集了相同的尿液(第二次晨尿)。此外，考虑到观察到的生物变异，我们收集了足够的简单样本量，以确定尿瘤和外泌体之间有统计学意义的两倍变化，P=0.05，功率为80%。

在我们之前的研究中，我们利用两个第二晨尿集合样本，在四个水溶性组分中鉴定出2251个蛋白质，在外泌体组分中鉴定出1615个蛋白质。在本研究中，我们在每个组分中鉴定出的蛋白质数量与本研究和之前的其他研究相当。通过统计学和生物信息学分析，我们在尿瘤和外泌体部分之间发现了两个不同的样本群，其内部同质性很高。外泌体表达的779个蛋白质与人类尿液外泌体数据库重叠，1615个蛋白质与之前的文献数据重叠。因此，在我们的研究中鉴定出的蛋白质中有83%是人类外泌体的已知成分，这证实了本研究对尿液外泌体进行了充分的分离。大多数外泌体蛋白为细胞质或膜蛋白，少数为细胞外蛋白。这一结果似乎并不令人惊讶，因为这些纳米囊泡在形成和排泄过程中会吸收细胞质中的蛋白质和微核糖核酸。

此外，外泌体蛋白质组分析表明，蛋白质围绕特定功能聚集。特别是，本研究报告了外泌体的一个有趣特征，即这些外泌体表达与代谢功能相关的蛋白质。我们以前曾对这一事实进行过研究，认为外泌体中表达的与新陈代谢相关的蛋白质可能是功能性的。实验数据表明，通过蛋白质组学对尿液外泌体中表达的蛋白质进行统计分析后得出的预测是可靠的。此外，显示尿液外泌体中有氧呼吸过程功能的数据与人类脐带胚胎间充质干细胞外泌体的数据一致。外泌体独立于线粒体进行有氧呼吸，而线粒体从未接触过中微粒体。深入研究表明，间充质干细胞和尿液中的外泌体代表了从本体到废液的连续统一体的两个极端，这表明进行有氧呼吸的能力可能是外泌体的共同特征，进一步的研究可能会证实这一点。

组装线粒体ETC复合物需要复杂的导入和折叠机制，很难设想外泌体也有这种机制。相反，由于外泌体的生物生成过程从未与线粒体接触过，因此外泌体所产生的MVB很可能吸收了线粒体内膜的蛋白质。考虑到OXPHOS机器是在线粒体中组装的，形成了一种被称为超级复合物的超微结构，我们假设这种超分子结构由于线粒体和内质网的异源融合而转移到了外泌体中。值得注意的是，线粒体和内质网之间的联系并不新鲜。一些研究报告称，这两个细胞区室之间存在磷脂交换。支持这一观点的事实是，线粒体在细胞中形成了一个动态网络，尽管线粒体被认为是一个半独立的动力室，但它们与细胞的其他部分相连，可以进行新陈代谢交换和交流。有人研究了线粒体和ER通过特定蛋白质(称为MAM(线粒体相关膜))的相互作用。

这一网络似乎是维持细胞平衡、生物能和存活的基础，最终决定了细胞在应激条件下的命运。在过去的几年中，我们中的一些人描述了一些组织中异位OXPHOS的活动，这些活动是由线粒体中的相同蛋白质执行的。此外，其他作者也报告了OXPHOS的异位功能表达。进一步的研究可能会评估我们报告的外泌体代谢活动的生理意义。

尿液是一种具有挑战性的环境，但我们还是分离出了保留其特殊蛋白质成分的外泌体。分离方法反过来又会对分离出的外泌体的完整性产生重大影响。尿液外泌体蛋白质组分析的额外分离步骤可通过不同的分离程序实现。我们这里采用的超速离心法被认为是分离外泌体的首选方法，也是纯化外泌体用于分离后分析的最常用方法。

数据表明，尿液蛋白质互补研究将受益于对外泌体的关注，因为外泌体的蛋白质比总尿液中的蛋白质保存得更有效。尿液及其外泌体有一个显著的优势，即可以通过非侵入性或微侵入性的方式轻松获取，其数量原则上不受限制。另一个优势是可以搜索生物标记物的表达，即可以识别其来自肾脏系统细胞的蛋白质。事实上，大多数尿液蛋白质都包含在囊泡中。发现肾衰竭的早期标志物尤为重要，因为大多数肾脏疾病的临床表现都较晚。外泌体可能浓缩了可通过免疫分离的生物标志物。此外，对分离出的外泌体中的RNA含量进行研究也可作为一种诊断工具：例如，有报告称这可用于癌症诊断。

5总结

总之，我们为了解健康尿液蛋白质组的各种成分做出了贡献，绘制了人类健康尿瘤与外泌体相比的详细蛋白质组图谱。此外，我们的外泌体蛋白质组图谱显示，这些蛋白质聚集在特定功能周围，其中一个功能与有氧代谢有关。数据显示了尿液外泌体中呼吸链复合物和TCA循环酶的功能表达。