2.7质谱仪设置

质谱仪LTQ-Orbitrap Velos Pro采用正离子模式。在Orbitrap中进行单次质谱扫描，记录350至1650m/z之间的质量窗口，最大离子注入时间为250毫秒。分辨率设置为60，000，自动增益控制设置为1，000，000离子。启用锁定质量选项后，可通过聚二甲基环硅氧烷背景离子(质子化(Si(CH3)2O))6；m/z 445.120025)对Orbitrap中记录的光谱进行内部重新校准。实验采用数据依赖采集模式，交替进行MS和MS/MS实验。触发MS/MS的最小MS信号设定为500个离子，使用2 Da的隔离窗口选择最突出的离子信号进行MS/MS。已被选中用于MS/MS的信号的m/z值被置于排除列表中60秒，排除窗口大小为±10ppm。在所有情况下，记录一次微扫描。线性离子阱中的CID目标值为5000个离子，最大离子注入时间为150毫秒，归一化碰撞能量为35%，Q值为0.25，激活时间为10毫秒。每次MS扫描最多触发20次MS/MS实验。

2.8数据分析

使用Thermo Scientific Proteome Discoverer软件1.3版处理原始MS文件。利用MASCOT和SEQUEST搜索引擎对包含正向和反向蛋白质序列的Uniprot人类数据库中的峰列表文件进行搜索。使用Percolator对搜索到的肽段进行过滤，使其FDR不超过1%，肽段质量偏差设置为10ppm，并且要求每个识别出的肽段至少包含6个氨基酸。数据库搜索参数为前体质量容差20ppm，片段质量容差CID 0.8 Da，动态修饰为脱氨基(N、Q)、氧化(M)，静态修饰为IAM烷基化(C)。在所有搜索中，都选择了胰蛋白酶进行两次漏切。蛋白质的分组采用了最大解析规则。用于确定蛋白质绝对定量的计算方法是取含量最高的三个肽段的平均值。

2.9统计和生物信息学分析

导出蛋白质特征和定量数据，用于进一步的统计和生物信息分析。每个无标签定量数据都按相应的尿量进行划分，并采用量化法进行归一化处理。归一化后，使用主成分分析(PCA)和斯皮尔曼相关性等无监督分层聚类分析来识别离群值和样本相似性。采用非参数曼-惠特尼U检验法检测外泌体和尿瘤样本之间的差异表达蛋白。使用本杰明-霍奇伯格假发现率(Benjamini-Hochberg false discovery rate)对P值进行多重检验调整。如果调整后的P值为0.05，且fold change<-2或>2，则认为蛋白质在两种情况下有显著差异表达。此外，蛋白质必须在两个队列中至少有50%的样本中被发现。火山图用于快速显示统计差异。不同样本蛋白质组的分层聚类分析结果通过热图的平均值显示。所有统计分析均使用R软件包进行。

Cytoscape软件用于基因本体和通路分析。根据从UniProt数据库中提取的基因本体注释，提交了外泌体和尿瘤间差异富集蛋白的统计列表，以确定外泌体囊泡中生物过程的富集情况。

2.10耗氧量和ATP合成测量

氧气消耗量是在配备有安培电极的恒温氧仪(Unisense微呼吸系统，UnisenseA/S，丹麦)上测定的。每次实验前用培养基平衡电极，并生成标准曲线。培养基包含120mM KCl、2mM MgCl2、1mM KH2PO4、50mM Tris-HCl、pH7.4和25μg/mL氨苄西林(最终体积1.7mL，温度23℃)。呼吸速率以nmol O/min/mg表示。

ATP合成采用荧光素/荧光素酶化学发光法测定，如报告所述。简而言之：样品首先在37℃下孵育10分钟：100mM Tris/HCl(pH7.4)、100mM KCl、1mM EGTA、2.5mM EDTA、5mM MgCl2、0.2mM二(腺苷-5′)五磷酸盐、0.6mM欧贝因、氨苄青霉素(25μg/mL)、5mM KH2PO4。为诱导ATP合成，在相同pH值的混合物中加入0.1mM ADP。然后用荧光素/荧光素酶化学发光法在发光仪中测量ATP浓度，ATP标准溶液在10-9和10-5M之间，用于校准。为了刺激由复合物I+III+IV组成的通路，氧消耗和ATP合成分析均使用了0.7mM NADH。为了刺激由复合物II+III+IV组成的途径，使用了20mM丁二酸。

3结果

图1分离的外泌体的特征。图A：分离的尿液外泌体的代表性透射电子显微镜图像。图B：通过动态光散射评估的外泌体大小分布图。该图显示了一个高斯分布曲线，平均峰值为80±8nm。

从6名男性和6名女性健康供体的第二次晨尿样本中获取外泌体和尿瘤。外泌体通过超速离心法分离。为确定其大小和形态，进行了透射电子显微镜(TEM)和动态光散射分析。图1A显示，超速离心得到的馏分由显示典型外泌体杯状形态的囊泡组成。通过动态光散射分析确定了囊泡的大小，结果显示囊泡呈高斯分布，平均峰值为80±8nm(图1B)。

采用两种不同的方法对获得的样本进行尿瘤特征测定。第一种方法是冻干100微克的等分样品，然后送去质谱分析(未经处理的部分)。第二种方法是在质谱分析之前，用有机溶剂处理相同数量的样品(100微克)，以富集疏水性较强的蛋白质(沉淀部分)，并用组合肽配体库珠子(CPLLbs)处理亲水相，以富集低丰度蛋白质(珠子和未结合部分)。

图2维恩图。A：外泌体和尿液中总蛋白质的维恩图；B：文献和我们的数据以及健康供体尿瘤中外泌体数据的维恩图，显示常见和不常见的蛋白质。数字代表各自重叠和非重叠区域中的不同蛋白质。

在外泌体、未处理、沉淀、珠子和未结合馏分中分别鉴定出1951、1176、993、1614和1347个蛋白质。各部分鉴定出的蛋白质数量相似。在尿瘤(共2469个蛋白质)中，珠状体(14%)、未结合(14%)和沉淀(3%)部分分别鉴定出354个独有蛋白质、345个独有蛋白质和85个独有蛋白质。相比之下，未经处理的样品中只发现了154个专属蛋白质(6%)。这证实了在质谱分析前进行样品分馏的优势，可以在蛋白质浓度动态范围较大的生物样品中鉴定出大量蛋白质。图2A显示了健康供体的外泌体和尿瘤蛋白质之间的重叠程度。共有3429个蛋白质存在，其中只有992个(29%)与外泌体和尿瘤相匹配。外泌体中的其余959个蛋白质(28%)和尿瘤中的1478个蛋白质(43%)不属于这两组中的一组。

12个生物重复序列的平均变异系数为0.5，各个蛋白质组之间没有发现任何关系。例如，它们没有因性别而聚类。此外，通过使用DellR.B报告的公式，我们可以得出结论：12个生物重复样本足以鉴定出两倍变化的定量蛋白质变异特征，显著性水平为0.05，功率为80%。

图3与外泌体和不同尿液组分的无监督分层聚类分析相关的主成分分析和斯皮尔曼相关图。样本来自21名健康捐献者。A，外泌体(圆圈)和尿液组分主成分分析的二维散点图，即：未处理(上三角)、沉淀(下三角)、珠子(正方形)和未结合(点)。B，斯皮尔曼相关图：系数值用从0.1(蓝色)到0.9(红色)的伪彩色标尺表示。此外，树状树枝图显示了无监督分层聚类分析的结果，将相似的斯皮尔曼系数值相互靠近。两幅图都显示了外泌体和尿瘤之间两个明显的独立聚类。

对不同的尿液组分和外泌体进行了主成分和层次聚类分析，以突出两组样本的异同。外泌体和其他尿液组分的主成分二维散点图显示，在所有样本中，外泌体和尿瘤的蛋白质都有很好的分离(图3A)。根据蛋白质组的丰度特征，使用与分层聚类分析相关的斯皮尔曼相关图也得到了相同的结果(图3B)。此外，不同尿液组分的平均斯皮尔曼系数(R2)(0.74±0.11)高于外泌体和尿液组分之间的平均斯皮尔曼系数(0.26±0.08)。这证实外泌体和尿瘤组是两个独立的群组。

图4外泌体和尿瘤分层聚类分析的火山图和热图。A，根据外泌体和尿瘤中所有已鉴定蛋白质的折叠变化(Log2)和P值(-Log10)绘制的火山图。白色圆圈表示外泌体和尿瘤中发生显著统计学变化的1660个蛋白质。共有1464个蛋白质在外泌体中富集(右侧)，而196个蛋白质在外泌体中代表性不足(左侧)。P值为>0.05的蛋白质显示为黑点。B，基于细胞组分基因本体注释的外泌体和不同尿液组分蛋白质组的无监督二维分层聚类热图。在热图中，每一行代表一种蛋白质，每一列对应每组12个样本的平均值。与每个蛋白质的平均值相比，蛋白质丰度的归一化Z评分用伪彩色标度表示，正表达(红色)、等表达(白色)和负表达(蓝色)。树状树枝图显示了无监督分层聚类分析的结果，将相似的蛋白质组特征值相互靠近。对树枝图和热图的目视检查表明，外泌体和尿瘤组有明显的聚类。

为了更好地描述这两组之间的差异，我们根据细胞成分基因本体注释，对蛋白质丰度进行了火山图和热图分层聚类分析。火山图显示，与尿瘤相比，外泌体中共有1660个蛋白质发生了显著变化。其中，1464个蛋白质在外泌体中富集(图4A)。蛋白质组谱热图显示，细胞质(34%)和细胞膜(21%)区明显富集的蛋白质占多数，而核区(13%)，特别是细胞外区(1%)与蛋白质组总量相比代表性不足。研究发现，葡萄糖代谢和呼吸链等代谢途径的蛋白质含量明显增加。特别是最后两种途径，在这里首次得到了强调。