摘要

外泌体是大多数细胞类型在多囊内体与质膜融合后释放的40-100纳米的囊泡。外泌体在包括尿液在内的体液中无处不在，含有来源组织特有的蛋白质和RNA。尿液中的外泌体作为一种很有前景的疾病生物标志物库，已被广泛研究。

在这里，我们报告了通过Orbitrap质谱对尿液外泌体与尿瘤进行比较的蛋白质组分析。我们对样本采用了一种发现方法。共发现3429种蛋白质，外泌体和尿瘤之间的重叠极少。外泌体中的959个蛋白质(28%)和尿瘤中的1478个蛋白质(43%)只存在于一组中。通过细胞图谱分析，生物过程基因本体与其功能性概率相关(P≤0.05)。这是以前从未研究过的，结果表明这些外泌体在新陈代谢功能，特别是有氧ATP生产功能方面具有显著的聚集性。尿液外泌体进行氧化磷酸化，能够合成ATP并消耗氧气。

人类尿液外泌体作为生物活性囊泡消耗氧气来有氧合成ATP，其功能是以前未曾想到的。正常人尿液蛋白质组的测定有助于建立健康尿液蛋白质数据库供比较，对各种肾脏疾病很有帮助。

生物学意义：所报告的研究结果代表了在了解健康人体尿液蛋白质组方面取得的重大进展。利用收集的蛋白质组数据进行分析的方法可以评估尿液外泌体与尿瘤的独特组成，并阐明前者中存在以前未知的分子通路。由于尿液外泌体的新陈代谢能力具有生物学意义，可能代表了其重要的一般特征，因此该论文有可能对其研究领域产生影响。

1引言

细胞会释放各种膜囊泡，其中包括外泌体。外泌体目前以其大小和膜成分为特征。外泌体从内体(多泡体，MVB)中萌发，内体可以与溶酶体融合，也可以在多泡体与质膜融合后分泌。纯化的外泌体不含血清蛋白或细胞内细胞器(如线粒体)的蛋白质成分，因为线粒体在其生物生成过程中从未与外泌体接触过。在外泌体中发现的蛋白质中，有许多不仅是参与多核生物体生物生成的机制的一部分，也是其来源细胞的一部分。所有体液(其中包括血浆、母乳和尿液)都含有外泌体。研究表明，人体尿液中的外泌体来自泌尿道和肾脏的各类细胞。由于尿液外泌体能够携带来自肾脏的信息，也可能通过血液携带来自全身的信息，因此人们对尿液外泌体的兴趣与日俱增。

通过几种蛋白质组学分析方案分析了不同来源外泌体的蛋白质含量。外泌体尿液蛋白质组已经编目。外泌体还富含脂质(胆固醇、鞘脂、磷脂)。外泌体的蛋白质和脂质组成与其生物生成有关。外泌体的RNA含量(其中包括miRNA)尤其重要，它可以传递遗传信息。造成外泌体蛋白质和RNA组成的分选信号尚不清楚。肿瘤细胞产生的外泌体在肿瘤发生和转移过程中发挥着积极作用。

尿液外泌体可抑制大肠杆菌的生长。事实上，尿液外泌体可被视为泌尿道内宿主防御的先天性免疫效应因子之一。由于外泌体易于获取，因此被认为是肾脏疾病和损伤生物标志物的潜在来源。

干细胞外泌体的一项有趣功能引起了研究人员的注意。研究表明，外泌体或分泌外泌体的间充质干细胞(MSC)可以挽救受伤细胞的有氧代谢，因此有人提出将外泌体用于再生医学。缺血细胞会迅速丧失ATP和NAHD含量，而间充质干细胞外泌体能在极短的时间内(约1小时)恢复ATP和NAHD含量，从而排除了DNA合成的参与。通过比较尿液外泌体、非尿液外泌体和尿瘤的蛋白质组，我们发现许多已鉴定的蛋白质都与有氧代谢功能有关，具有很高的功能性。有趣的是，人脐带间充质干细胞分泌的外泌体有能力进行氧化磷酸化。

为了进一步研究外泌体的生物能作用，我们通过蛋白质组分析对外泌体进行了分析。我们还将外泌体蛋白质组与尿瘤进行了比较。

2材料与方法

2.1尿液收集和分馏

在征得知情同意后，收集12名健康捐献者(6男6女)的第二次晨尿，并按照标准方案(见EuroKUP-European Kidney和尿液蛋白质组学网站)立即在4℃下以1000g离心10分钟以去除细胞碎片。上清液分为两份。第一份用水透析并冻干，得到未经处理的部分。第二份上清液在JA-20转子(BeckmanAvanti™J-25)中以17000g离心75分钟，温度为16℃，以去除尿液中的微小颗粒沉淀物。上清液在Ti90转子(BeckmanOptima™l-90K)中以100000g、18℃超速离心75分钟，以分离外泌体囊泡。颗粒在PBS中洗涤三次，最后在DTT(100mg/mL)和Tris-HCl 65mM pH8.8中洗涤，以去除尿液样本中的蛋白质，然后在16000g下于4℃离心10分钟。

100000g的上清液与水进行透析；50mL的等分液加入100μL的醋酸(pH值约为3-4)和10mL的正丁醇，然后在18℃下以3000g离心10分钟。得到三个不同的阶段：蛋白质颗粒(沉淀部分)、上清液和色素(弃掉)。

在ProteoMiner™色谱法中，将有机溶剂提取产生的未丢弃的上清液冻干，在25mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中溶解，然后装入150μL组合肽配体库微珠柱中，如前所述，微珠柱在相同的缓冲液中平衡，以获得微珠和未结合部分。

最后，将尿液馏分保存在-80℃，直至质谱分析。所有尿液馏分的蛋白质浓度均用布拉德福德法估算。

2.2动态光散射

使用Zetasizer nano ZS90粒度仪以90°固定角度测量外泌体的大小。粒子直径通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算得出。对于溶液中的粒径测量，外泌体等分样品在PBS:H2O(1:10)溶液中稀释，并在25℃恒定温度下进行研究。分析了六个独立的等分试样(3男3女)，每个等分试样取三个技术重复。使用仪器提供的分散技术软件采集和分析数据。

2.3透射电子显微镜

用2%v/v多聚甲醛溶液(PBS)固定外泌体，然后将其滴在涂有碳的铜栅上，在室温下晾干20分钟。快速清洗后，在PBS中用1%w/v戊二醛固定铜网，并在蒸馏水中冲洗数次。用4%w/v醋酸铀酰和UA-甲基纤维素混合溶液对样本进行对比。网格在室温下干燥，用Tecnai 12 G2透射电子显微镜观察，然后用奥林巴斯iTEM软件进行分析。

2.4外泌体表面生物素标记和二维电泳

新鲜尿液外泌体在冰冷的PBS中冲洗三次，表面用2mM的EZ-linksulfo-NHS-LC-LC-生物素标记，4℃5分钟。用冰冷的150mM NaCl和20mM Tris-HCl pH7.5(TBS)加100mM甘氨酸冲洗外泌体三次，以淬灭和去除过量的生物素试剂。外泌体提取物按照之前的方法在2-DE上运行。简单地说，将清洗和沉淀的生物素化外泌体溶解在样品聚焦溶液中，即7M尿素、2M硫脲、4%w/v CHAPS和50mM二硫代赤藓醇(DTE)，然后装载到自制的pH3-10非线性软IPG条(18厘米长、3毫米宽、0.5毫米厚)上。条带在室温下于聚焦溶液(即7M尿素、2M硫脲、2%w/v CHAPS、15mM DTE和0.6%v/v载体两相溶解物鸡尾酒，其中pH3.5-10间距为40%，pH4-8间距为60%)中膨胀过夜。在20℃、≤50mA的条件下对蛋白质进行带状聚焦，电压逐渐升高，总电压为90，000Vh。在含有6M尿素、50mM Tris-HCl pH8.8、2%w/v SDS、30%v/v甘油和微量溴酚蓝的平衡缓冲液中平衡30分钟。使用Protean II XI系统(Bio-Rad)进行SDS-PAGE二维分离(T%8-16)。蛋白质用银染色(150μg)或转移到硝酸纤维素膜上(300μg)，并在1%(重量/体积)聚乙烯吡咯烷酮溶液(TBS)中达到饱和。然后用TBS-Tween 0.05%v/v(TBS-T)冲洗膜，并与中性葡萄蛋白(50pg/mL，Thermo Scientific)或抗ATP5B抗体(SIGMA)在TBS-T中的1%w/v BSA中孵育。化学发光用于检测。分别使用GS-800扫描仪或VersaDoc 4000(Bio-Rad)将图像数字化，用于整个外泌体蛋白显像或表面生物素标记实验和抗ATP5B抗体检测。使用PDQuest软件(Bio-Rad)进行图像分析。

2.5质谱分析

所有样品均采用线性阱式四极杆(LTQ)Orbitrap Velos Pro质谱仪进行分析。

2.6用于质谱分析的尿样制备

样品在0.1mL 4%w/v SDS、50mM DTT和0.1M Tris/HCl(pH7.6)溶液中溶解，90℃5分钟，超声处理，然后使用30 k Vivacom过滤装置按FASP程序处理。简而言之，将50μL等分样品与0.2mL 8M尿素和0.1M Tris/HCl(pH8.5)(UT)混合，装入过滤装置并在14，000g转速下离心15分钟。浓缩物在装置中用0.2mL UT溶液稀释后再次离心。离心后，浓缩物与0.1mL 50mM碘乙酰胺UT溶液混合，室温下黑暗培养30分钟，然后离心15分钟。然后，用0.2mL pH8.5的0.1M Tris/HCl中的8M尿素稀释浓缩物，并再次浓缩。此步骤重复两次。然后用120μL含有1μg胰蛋白酶的40mM NaHCO3稀释样品。消化过夜后，过滤装置离心20分钟收集肽，然后用50mL 0.5M NaCl冲洗过滤装置并离心，以抑制疏水作用。