2.材料与方法

2.1光生物反应器的启动和运行

为了评价在ABA系统中同时进行吡啶生物降解和脱氮的可行性，我们采用了两个由工作体积为2.5L、高径比为3的有机玻璃制成的管状连续流光生物反应器（PBRs），平行运行75天，PBRs的构型如图S1所示。LED灯安装在PBRs周围，以提供密度为180μmol·m-2·s-1的光，每12小时开或关一次灯。反应器运行温度保持在25±2℃。在水力保留时间（HRT）下，将合成废水泵入两个PBRs。其中一个PBRs由预培养的藻-菌群接种，以PBR-0命名，而PBR-1由藻-菌群和来自城市污水处理厂（中国南京）的活性污泥接种。以副球菌（Paracoccus sp.NJUST47）和小球藻（Chlorella sorokiniana FACHB-275）为接种物，预培养48 h。副球菌为吡啶降解菌，小球藻为典型藻类。将小球藻和副球菌分别接种到PBRs中，细胞密度分别为（4.17±1.24）×106 cell·mL−1和（6.55±3.18）×106 CFU·mL−1。将活性污泥接种到PBR-1中，混合液悬浮物（MLSS）浓度为1000 mg·L−1。

合成废水的制备方法如下：磷酸盐缓冲液（7 mM），CaCl2·2 H2O(0.036g·L−1),MgCl2·6H2O(0.16g·L−1),碳酸钠(0.02g·L−1)、EDTA(1mg·L−1)和微量元素溶液(1mL·L−1).磷酸二氢钾和12水磷酸氢二钠作为磷酸盐缓冲液，控制pH7.2±0.1。微量元素溶液中含有硼酸(2.86g·L−1),4水氯化锰(1.81g·L−1),7水硫酸锌(0.222g·L−1),5水硫酸铜(0.079g·L−1),NaMoO4.2H2O(0.390g·L−1)，Co(NO3)2·6 H2O(0.0494g·L−1)。150mg·L−1吡啶作为唯一的有机碳和氮源加入到合成废水中，是真实废水中的典型浓度。相应地，吡啶和氮的负载速率为75g·m-3·d·L−1和13.3g·m-3·d·L−1，C/N比为4.3。

2.2分批式反应器和PBRs的操作

根据之前的研究，在PBR-1操作过程中进行了非原位分批实验，研究了光照强度、额外的碳源和额外的硝酸盐对吡啶和氮去除的影响。分批反应器由相同的200mL玻璃血清瓶建立，用带有橡胶隔膜的铝卷曲盖密封，并以100rpm和25±2℃的条件放置在振动台上。以PBR-1中提取的ABA生物量进行分批试验接种。对于如表S1所示的分批实验的操作条件，如果没有特别说明的话，在合成废水中加入浓度为150mg·L−1的吡啶，光强设置为90μmol·m-2·s-1。为了确认硝化作用在ABA体系中的作用，在50 mg·L−1烯丙基硫脲（ATU）存在下评估了吡啶和脱氮性能，该烯丙基硫脲（ATU）经常使用作为硝化抑制剂。为了验证反硝化作用，以吡啶/硝酸盐摩尔比为0.5的硝酸盐作为电子受体加入。为了研究光密度的影响，间歇式反应器使用LED照明装置在90、180和270μmol·m-2·s-1的光强度下运行。为了研究外部碳源的影响，根据完全反硝化，以1.9 mM的化学计量法加入醋酸盐，C/N比为6.0。

2.3显微分析

为了进行荧光原位杂交（FISH）分析，在第75天从PBR-1中提取ABA样品，用薄刀片将ABA切割成横截面。此后，根据Lukumbuzya等人的方法制备样品。使用以下探针：由TAMRA标记的NSO190，对氨氧化β变形菌特异性；Ntspa662用VIC标记，靶向所有硝基螺旋菌；PAR1457由太平洋蓝标记，用于识别反硝化菌；和覆盖大多数细菌的Cy5标记的EUB338。藻类可以通过叶绿素的荧光来观察。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）（A1 HD25-TI2-U，Nikon，Japan）观察荧光。此外，使用微电极自动化系统（PA2000，Unisense，Denmark）测量光相期间ABA内的DO和pH分布。

2.4元转录组学和酶活性分析

在第75天从PBR-1和PBR0中提取藻类-细菌污泥样本，以进行元转录组学和酶活性分析。元转录组测序、组装和分析在中国马约比奥-上海进行。简单地说，使用E。Z.N.A.®土壤RNAMidi试剂盒(OmegaBio-tek，诺克罗斯，GA，US.)，根据制造商的协议。用NanoDrop2000(赛默飞雪科学公司，US.).根据制造商的说明，使用核糖体零磁性试剂盒对样品的总RNA进行rRNA去除程序。使用TruSeq™RNA样本制备试剂盒（Illumina）构建cDNA文库。根据制造商的说明，在有限公司Majorbio Bio-Pharm技术有限公司的Illumina Hiseq 2500平台上，使用Hiseq 4000 PE Cluster Kit和Hiseq 4000SBS Kit对条形码库进行配对末端测序。每个样本的开放阅读框（ORFs）都使用转基因扫描进行预测。所有利用CD-HIT技术将序列一致性为95%（覆盖率为90%）的序列聚类为非冗余基因目录。将质量控制后的Reads定位到具有95%同源性的代表性基因上，并使用RSEM评估FPKM。采用BLASTP进行非冗余基因注释，将非冗余基因目录与NCBINR数据库进行对齐，e值截止值为1e−5.使用BLASTP对KEGG数据库进行KEGG注释。此外，通过在UniProtKB上搜索辅助基因调控因子、群体感应（QS）和自诱导器等关键词，建立了本地QS数据库。

氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧化酶（HAO）这两种关键硝化酶，以及硝酸还原酶（NAR）、亚硝酸盐还原酶（NIR）、一氧化氮还原酶（NOR）和一氧化二氮还原酶（N2OR）这四种反硝化酶的活性，使用相应的硝化和反硝化酶联免疫测定（ELISA）试剂盒（上海景康生物工程有限公司，中国）进行分析。

2.5分析方法

在分析前，所有的水样在采样后立即通过0.22µm的膜进行过滤。采用高效液相色谱法（HPLC，e2695，Waters）对吡啶进行了鉴定和定量。溶解有机碳（DOC）浓度用TOC分析仪（VARIOTOC，元素，德国）测量。NH4+-N是采用奈斯勒试剂比色法进行分析。分别采用N-（1-萘）盐酸乙二胺分光光度法和2-异丙基-5-甲基酚分光光度法测定NO2--N和NO3--N。采用Hach试剂的过硫酸盐氧化分光光度法测定TN。采用HPLC/MS技术鉴定吡啶生物降解中间体，并配备ABSCIEXTrapleTOF5600+HPLC系统、离子阱质谱仪和电喷雾电离源。生成的气体混合物通过气相色谱与FID和TCD探测器进行气相色谱（GC-2014C，日本）进行分析。总氮（TN）包括液体中的氮（TNLiquor）和生物量中的氮(TNBio)。硝化-反硝化对TN的去除可以根据TNinitial和TNfinal之间的差异来评估。液体中的氮（TNLiquor）的去除可归因于同化和硝化反硝化对TN的去除。同化法对TN的去除可以根据液体中的氮（TNLiquor）去除和硝化反硝化法对TN去除的差异来计算。根据进水TNLiquor（吡啶-N）和出水TNLiquor（吡啶氮、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的总和）的差异计算TNLiquor的去除率总N计算清液量基于进水的差异TNLivul（吡啶氮）和废水TNLivul（吡啶氮、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的总和）。

硝化反硝化对TNLiquor的去除贡献可以通过以下方程进行评估：

通过同化去除TN对TNLiquor去除的贡献可以通过以下方程进行评估：