5.siRNA-GPR4可降低酸性微环境中EPC的血管生成能力

图5：GPR4水平的变化影响酸介导的EPCs血管生成。a,b不同pH环境下非CAD和CAD患者EPCspSTAT3、STAT3和VEGFA蛋白表达的代表性照片和定量分析。c-f不同pH环境下非CAD和CAD患者EPCs中p-STAT3、STAT3和VEGFA蛋白表达的代表性照片和定量分析。用siRNA-GPR4和阴性对照siRNA（NC）或表达GPR4的质粒、阴性对照质粒（NC）和NSC74589转染EPC。

此外，我们还研究了GPR4信号通路激活对STAT3磷酸化（p-STAT3）和VEGFA表达的影响。我们的数据显示，与非CAD患者相比，p-STAT3和VEGFA的表达在pH值为6.4时明显降低，而在pH值为7.4时组间差异不显著（图5a，b）。为了进一步证实GPR4在酸性微环境中的血管生成能力，我们用siRNA沉默了EPCs中GPR4的表达。免疫印迹证实了GPR4、STAT3和VEGFA在EPCs中的表达。我们的数据显示，siRNA-GPR4在pH6.4时会降低p-STAT3和VEGFA的表达，但在pH7.4时不会（图5c，d）。

6.STAT3抑制剂可阻断GPR4上调后体外和体内血管生成的增加

图6：GPR4在酸性微环境的刺激下通过STAT3信号通路调节来自CAD患者的EPCs中VEGFA的表达。a,b在不同pH环境的EGM培养基中培养6h后定量分析管形成（a）和迁移（b）。c注射转染了阴性对照质粒（NC）或表达GPR4和NSC74859的质粒的EPC后，裸鼠后肢缺血血流的代表性照片和定量分析。d缺血后肢的HE、IHC-CD31、IF-CD31和BrdU染色切片。

我们的数据表明，STAT3抑制剂NSC74859可以降低GPR4基因转移上调的VEGFA水平（图5e、f），这一发现也与迁移和基质胶实验结果平行（图6a、b）。此外，NSC74859还消除了GPR4基因转染引起的裸鼠后肢皮下血流增加（图6c）。后肢的免疫组化和免疫荧光见图6d。

讨论：

我们目前的研究发现，与健康人相比，CAD患者体内GPR4的表达明显减少，这导致EPCs在酸性缺血环境中的血管生成能力受损。GPR4表达的上调明显提高了CAD患者体内和体外酸性微环境中EPCs的适应性血管生成能力。从机理上讲，GPR4表达的增加可增强H+的结合，导致下游STAT3/VEGFA信号通路的表达增加，最终加速EPCs的血管生成。GPR4可能是EPCs适应酸中毒环境和恢复受损血管生成能力的一个有前途的靶点。

人们普遍认为，EPC是血管修复和再生医学中移植治疗的重要组成部分。尽管基于EPC的CAD实验研究正在广泛展开，但尽管一些研究观察到功能改善，但仍存在争议。其中，来自CAD患者的EPC数量较少且功能受损。因此，探索EPCs在酸性条件下的治疗模式及其内在机制至关重要。

酸性微环境作为缺血的病理生理化学因素，可能会显著影响动员的EPCs的功能。有趣的是，以前的数据表明，EPCs暴露于酸性介质对细胞功能有双重影响。人们普遍认为，酸性微环境会对干细胞/祖细胞产生额外的破坏作用，因为细胞外pH值的降低会诱导细胞酸化，从而导致细胞死亡。另一方面，越来越多的数据显示，酸性环境也能提供增强细胞能力的刺激，这表明严峻的微环境能激发细胞自我适应/防御，以保持其能力。值得注意的是，有证据表明，在适当的时候，酸性微环境可以促进健康人的EPCs血管化。

越来越多的数据表明，H+可引发微环境对各种细胞（如癌细胞和内皮细胞）的影响，质子感应GPCR被认为是介导下游细胞内信号通路的相关受体。Wyder等人的研究表明，与野生型小鼠相比，缺乏GPR4的小鼠的肿瘤生长、细胞增殖以及血管形态、长度和密度的改变都严重减少。鉴于质子感应GPCR与酸中毒之间的关系，质子感应GPCR家族成员可能在EPCs中发挥作用，并在CAD患者的EPCs中退化。有趣的是，Ding等人发现质子感觉蛋白OGR1通过酸激活介导了对EPCs增殖和血管生成的抑制作用。在本研究中，我们评估了EPCs中质子传感GPCR的水平，与OGR1、TDAG8和G2A相比，GPR4的表达相对丰富，这表明EPCs可能通过GPR4感知局部酸性微环境，以调整自身适应破坏性环境。此外，与健康受试者相比，CAD患者的EPC中GPR4的表达明显减少，这与酸性诱导的新生血管生成受损相一致。因此，EPCs的GPR4表达和血管生成能力的平行趋势表明，GPR4可能介导了酸性微环境中EPCs细胞功能的异常。我们的研究结果进一步证明，EPC中可能存在各种质子感应GPCR，它们在酸性环境中可能会相互影响。

据报道，GPR4在肿瘤和血管内皮细胞中过度表达，可诱导血管生成增加。有趣的是，在一些研究中，GPR4的过表达也呈现出负的细胞活性，这表明GPR4对不同类型细胞的影响是有争议的。Kim等人报道，SPC/GPR4相互作用诱导体内EC的血管生成，磷脂酰肌醇-3激酶和Akt的激活均参与其中，这表明GPR4可能是EC血管生成能力的关键调节因子。Ren等人进一步揭示，GPR4的过表达介导了Notch1信号的细胞延伸，而这一增量与体外HMEC-1细胞内皮管形成的增加相关。因此，GPR4可作为内皮细胞系血管稳态的靶点。为了进一步证明GPR4在EPC介导的CAD患者血管生成能力中的作用，我们通过pcDNA3.1(+)-GPR4提高了GPR4的表达，并刺激EPC对酸性刺激做出反应。事实上，我们的研究结果表明，与pH值为7.4的正常微环境相比，pcDNA3.1(+)-GPR4基因转移可促进pH值为6.4的CAD患者EPC的血管生成。与此相一致，我们的数据显示，在体外和体内pH值为6.4时，GPR4表达的增加与EPC粘附、迁移和管道形成能力的增加是平行的。此外，siRNA-GPR4基因转移诱导健康受试者的EPC中GPR4表达减少，EPC的体内外能力在pH6.4时也出现下调。然而，在pH值为7.4时，EPCs并未出现上述功能变化。因此，我们目前的研究表明，GPR4表达的降低至少部分导致了酸性环境下CAD中EPC介导的血管生成下降，为我们理解酸性微环境中的EPC血管生成功能障碍的分子机制提供了新的见解。

转录信号转导和激活因子（STAT）家族是细胞质转录因子，可促进细胞内信号通路对细胞因子和因子的反应。它由七个成员组成：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6。STAT3被认为能促进细胞的生长和存活、血管生成、迁移、侵袭或转移，有报道称它受GPCRs的调控。先前的研究表明，在酸性肿瘤环境中，通过抑制STAT3VEGF在体外和体内的表达，可减轻乳腺癌细胞的血管生成和肿瘤生长。此外，STAT3诱导的血管生成也在其他类型的细胞中得到证实，如肝细胞癌。因此，我们提出了一个假设，即STAT3可能是与酸有关的EPCs血管生成信号通路的重要步骤之一。然而，STAT3是否能激活酸介导的新生血管形成仍是未知数。在我们的研究中，我们发现转染GPR4提高了CAD患者EPCs的血管生成能力并增加了VEGFA的表达，而敲除GPR4则抑制了血管生成能力。此外，我们的数据还显示，p-STAT3/STAT3的比值增加，这与VEGFA表达的增加和GPR4表达的改变相一致。这些结果表明，GPR4介导的酸诱导血管生成与STAT3/VEGFA通路之间可能存在相关性。此外，当STAT3被阻断时，酸性微环境介导的血管生成中增加的体外和体内EPCs功能受到抑制。这些结果表明，GPR4/STAT3/VEGFA信号通路参与了酸性微环境中EPC的功能调节。

然而，我们目前的研究还存在一些局限性。首先，酸性微环境是一个由多种质子感应蛋白组成的复杂微系统。GPR4信号与其他受体的联系还需要进一步研究。此外，与CAD发病率和预后相关的GPR4信号通路也值得阐明。

结论：

总之，本研究首次证明了GPR4/STAT3/VEGFA信号通路导致EPCs血管生成能力受损，而提高GPR4可恢复CAD患者EPCs的血管生成能力。这些发现为治疗CAD提供了新的细胞治疗靶点。