动物模型和体内血管生成试验：

股动脉结扎（FAL）和体内血管生成试验按照之前的研究进行。简而言之，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，并切除它们的后肢。体温保持在37.0±0.5°C。通过一个2毫米的切口暴露左股动脉，切口不牵拉，尽量减少对组织的干扰。在股外侧尾动脉和上浅动脉起源的远端以及股动脉的近端（腹股沟韧带下方）放置一个7-0结扎。在缝线之间横断股动脉并分离1-2毫米，用生理盐水清洗伤口并密封。最后，注射丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/千克）。

为了评估培养的EPCs的血管生成能力，将不同组（包括GPR4上调组和GPR4基线组）的EPCs（5×105个细胞）重悬于100-200μl的预热PBS（37°C）中，然后移植到结扎动脉附近的5个部位。安慰剂小鼠也注射相同体积的PBS。使用激光多普勒成像仪检测后肢皮下血流。分别在注射后0、3、7、14和21天测量缺血和非缺血后肢的血流量。21天后，小鼠被处死。肢体缺损评分按以下等级计算：0=无，1=趾尖坏死，2=趾部坏死，3=足部坏死，4=腿部坏死，5=整条腿缺失。

免疫组化和免疫荧光分析：

免疫组化染色如前所述。简言之，进行右股动脉结扎和股浅动脉（SFA）切除。在0.01M柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中通过微波炉加热进行复水和抗原回收。按照制造商的说明，用兔单克隆PECAM-1抗体孵育切片，然后用HRP抗兔DAB检测试剂盒检测。使用光学显微镜获取免疫组织学图像。血管密度通过计数CD31切片免疫组化染色中的血管数量确定，并以每平方毫米血管数表示。

为了进行免疫荧光分析，所有切片都用一抗在4°C孵育过夜，然后用GFP结合物山羊抗兔二抗染色。为了评估不同组的细胞增殖情况，手术后2周内每天两次皮下注射，组织切片也用Cy5结合的抗BrdU抗体（Sigma）染色，以评估毛细血管密度。细胞核用DAPI反染。使用共聚焦显微镜获取免疫荧光图像。

Real-timePCR检测：

用高纯度RNA分离试剂盒提取总RNA。使用PrimeScript®RT试剂盒合成第一链cDNA。使用StepOnePlus实时PCR系统，采用2-ΔΔCT分析方法对该家族的mRNA表达进行量化，一式三份。GPR4的PCR引物如下：正向5′-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3′，反向5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3′。扩增GAPDH作为内标。用2(-DeltaDeltaC(T))法测定每个样本中的相对RNA水平。

液滴数字PCR检测：

液滴数字PCR（ddPCR）和基于EvaGreenChemistry的数据分析按照生产商的说明进行。Supermix(2X)购自美国Bio-Rad。PCR中引物的最终浓度为200nM，最终反应体积为20μL。每个反应有1μLcDNA，NTC时加入1μL无核酸水代替cDNA。使用BioRad自动液滴发生器生成液滴。PCR条件如下95℃5分钟，50℃30秒，56.5℃30秒，72℃45秒。最后在72℃延伸5分钟，然后在4℃5分钟和90℃5分钟进行信号稳定步骤。PCR结束后，使用QX200液滴阅读器分析液滴，并使用Bio-RadQuantaSoft软件分析数据。

Western印迹分析：

细胞在添加了1-mMPMSF的RIPA缓冲液中裂解。蛋白提取物经SDS-PAGE处理后转移到聚偏氟乙烯膜上。使用以下抗体：兔抗GPR4抗体、抗VEGFA抗体和兔抗GAPDH抗体。蛋白用HRP结合的抗兔IgG显色，然后使用ECL化学发光系统显色。

统计分析：

所有结果均表示为标准差±均值，通过学生t检验或方差分析评估统计学显著性。P<0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析均使用SPSS统计软件（SPSS版本21.0）进行。

结果：

1.表型特征

图1：培养28天后EPC的表型特征。a通过流式细胞术确定EPC的细胞表面标记。B EPC对DiI-acLDL摄取和FITC标记的UEA-1结合均呈阳性。细胞核用DAPI（蓝色）染色。c循环EPCs在培养后不同时间点（第0天、第7天和第28天）的形态变化序列。

共有20人参加了研究，其中CAD组和健康组各有10人。两组基线特征无明显差异。晚期EPC由培养28天的PBMNCs获得（图1c），与之前的研究类似。培养28天后，通过流式细胞术分析培养的EPCs的标记蛋白，包括KDR、CD31和CD144（图1a），EPCs的DiI-acLDL摄取和FITC标记的凝集素-1结合均为阳性（图1b）。

2.不同的EPC在酸性环境中具有不同的血管生成能力

图2：不同pH环境对来自非CAD和CAD患者的EPC血管生成的影响。a,b不同pH环境培养6h后，EPC管形成（a比例尺=40μm）和迁移（b比例尺=20μm）的代表性照片和定量分析。c来自非CAD或CAD后肢缺血的EPC介导的新生血管的代表性照片和定量分析。D HE、IHC-CD31、IF-CD31和BrdU染色的后肢缺血切片，以及CD31阳性血管、CD31阳性微血管和BrdU阳性细胞的定量分析。

为了确定不同患者EPC的体外血管生成能力，采用了Matrigel实验。与在pH值为7.4的环境中相比，非CAD组的EPCs在酸刺激下的血管生成明显增强，而CAD组的EPCs在相同处理下的结果则相反（图2a）。伤口愈合的结果也类似（图2b）。为了进一步探讨这些结果的稳健性，我们将非CAD组和CAD组的EPCs全身注射到后肢缺血的裸鼠体内，结果显示，与注射CAD组EPCs的裸鼠相比，注射非CAD组EPCs的裸鼠血流恢复更快（图2c）。后肢的免疫组化结果见图2d。

3.EPC上质子传感G蛋白偶联受体的表达

图3：非CAD和CAD患者EPCs中质子传感GPCR家族的表达和血管生成能力。a使用dPCR测定EPCs中质子感应GPCR家族表达的mRNA水平。b,c GPCR家族蛋白质水平的代表性照片和定量分析。d dPCR用于测定不同pH环境中GPR4的mRNA水平。e不同pH值环境下GPR4表达的定量分析和代表性照片，然后用GPR4抗体进行免疫印迹。f,g用siRNA-NC或siRNA-GPR4转染EPCs，拍摄Matrigel管样形成试验（比例尺=40μm）和划痕试验（比例尺=20μm）的代表性照片并进行定量分析。

与使用ddPCR对其他类型细胞进行的研究类似，我们的结果显示，四种类型的质子传感G蛋白偶联受体亚型均在EPCs上表达，其中GPR4的表达量最高，这一点在Western印迹中得到了进一步证实（图3a-c）。此外，ddPCR和Western印迹结果显示，在酸性环境中，CAD患者的GRP4表达量明显低于非CAD患者，而无论pH值如何，组间差异均未达到统计学意义（图3d，e）。在使用siRNA-GRP4下调GRP4表达的CAD患者的EPCs中，我们发现EPCs的体外血管生成能力在酸性环境中受损，而在pH7.4环境中没有受损（图3f），伤口愈合试验也得出了类似的结果（图3g）。

4.GPR4基因转移增强了酸性微环境中EPC的血管生成能力

图4：GPR4基因转移可恢复CAD患者EPCs酸性介导的血管生成。a,b EPCs在不同pH环境中培养6h后，管形成（a比例尺=40μm）和迁移（b比例尺=20μm）的代表性照片和定量分析。c注射EPCs后裸鼠后肢缺血血流的代表性照片和定量分析。d缺血后肢的HE、IHC-CD31和IF-CD31染色切片。

将人类GPR4cDNA克隆到真核表达质粒中。Western印迹证实了GPR4在EPCs中的转录和表达。与载体转导的EPCs相比，pcDNA3.1(+)-GPR4转导的EPCs在酸性微环境中的血管生成明显增强，而在pH值为7.4的环境中，组间差异未达到统计学意义（图4a，b）。

为了确定GPR4基因转移对EPC介导的体内血管生成的影响，将pcDNA3.1(+)-GPR4转导的EPCs和载体转导的EPCs全身注射到后肢缺血的裸鼠体内。值得注意的是，与载体转导的EPCs相比，pcDNA3.1(+)-GPR4转导的EPCs能明显增加裸鼠后肢皮下血流量（图4c）。后肢的免疫组化和免疫荧光见4d。