摘要：

冠状动脉疾病（CAD）患者的特点是血管再生能力下降，这与内皮祖细胞（EPCs）的功能障碍有关。G-蛋白偶联受体4（GPR4）是一种质子传感G-蛋白偶联受体（GPCR），有助于酸性微环境中的血管新生。然而，GPR4在调节CAD患者的EPCs对缺血组织中产生的酸性的血管生成能力方面所起的作用仍完全不清楚。

评估了从CAD患者和健康人体内采集的EPC在不同pH值环境下的血管生成能力。在体外和体内分析了GPR4调节EPC介导的血管生成的功能。通过基因过表达和抑制进一步研究了其下游机制。

酸性环境预刺激可显著增强非CAD组EPCs在体内和体外的血管生成能力，而同样的处理方法在CAD组中却产生了相反的结果。在四种典型质子感应GPCR中，GPR4在EPCs中的表达量最高。CAD患者的EPCs中GRP4的表达明显低于非CAD患者的EPCs，与酸刺激无关。siRNA介导的GPR4敲除以及STAT3磷酸化的降低模拟了CAD患者的EPCs在pH6.4而非pH7.4下的功能受损。通过激活STAT3/VEGFA信号，提高GPR4的表达可恢复CAD患者的EPCs在酸性环境中介导的新血管形成。此外，阻断STAT3/VEGFA信号通路会减弱GPR4上调对EPC介导的血管生成能力的有益影响。

本研究首次证明，GPR4的缺失是导致CAD患者EPCs质子感应和血管生成能力下降的原因。增强GPR4的表达可通过激活STAT3/VEGF信号促进EPCs新血管的形成。这一发现表明，GPR4是治疗以缺血组织血管新生能力受损为特征的CAD的潜在靶点。

引言:

冠状动脉疾病（CAD）是全球死亡的主要原因。冠状动脉部分或完全堵塞引起的供血中断会导致心肌缺血、心肌梗死（MI）以及随后的功能衰退。通过新血管的有效发育恢复心肌缺血部位的血液供应可减少心肌坏死，并大大改善CAD患者的预后。先前的研究表明，内皮祖细胞（EPCs）通过招募到缺血部位并促进血管再生，有助于心肌损伤的修复。然而，EPC在缺血微环境中介导新生血管形成的控制机制在很大程度上仍然未知。

由于灌注不良，无氧糖酵解在代谢过程中占主导地位，并导致乳酸和H+浓度增加，从而导致缺血部位局部酸中毒。哺乳动物冠状动脉结扎模型表示pH值从7.4降至5.5。因此，CAD患者的EPC在进入缺血部位时会暴露在酸性微环境中。酸性微环境可能会导致细胞外基质降解、减弱免疫反应并改变细胞和细胞间的信号传递。酸性细胞外pH值对血管生成过程有多方面的影响。最近的研究表明，酸性预处理可大大提高缺血部位内皮集落形成细胞的存活率和血管生成活性。然而，损伤组织内迁移的和局部的EPC对酸性的反应性较差，这又限制了CAD患者心肌缺血部位血管再通的进行。

G蛋白偶联受体4（GPR4）是一种pH感知型G蛋白偶联受体，在血管内皮细胞中高表达，可被缺血微环境中的质子激活。先前的研究表明，GPR4可在酸性pH值下促进血管生成，并能调节血管内皮细胞的管形成、迁移和增殖。GPR4基因敲除小鼠的血管形态发生改变，血管长度和密度减少。此外，GPR4缺失会导致内皮细胞中血管内皮生长因子受体2（VEGF2）水平降低。这些结果表明，内皮细胞介导的血管再生需要GPR4。然而，人们对GPR4是否介导缺血组织中产生的酸性反应和CAD患者EPCs的血管生成能力知之甚少。

在本研究中，我们假设GPR4是调节EPC细胞外pH响应的重要标志物，而GPR4表达的升高可以改善CAD患者EPC的血管生成功能。针对这些假设，研究人员评估了健康对照组和CAD患者的EPC上GPR4的表达水平。然后，在增强EPCs中GPR4的表达后，对其在裸鼠后肢缺血模型中的体外功能和体内血管生成能力进行了检测。从化学生物学的新视角来看，本研究可能发现GPR4是缺血组织中EPC酸性微环境的关键传感器，可作为预防和治疗CAD的靶标。

材料与方法:

外周血单核细胞（PBMNC）的分离、后期EPC培养和流式细胞术分析:

如前所述，PBMNCs是通过Ficoll密度梯度离心从健康人和CAD患者身上分离出来的，而晚期EPCs则是按照所述方案培养和鉴定的。简言之，将PBMCs培养在纤维粘连蛋白涂层的6孔板上，EBM-2（内容物：抗坏血酸0.5ml、rhFGF-B 2.0ml、肝素0.5ml、GA-1000 0.5ml、rhEGF 0.5ml、氢化可的松0.2ml、VEGF 0.5ml、R3-IGF-1 0.5ml），辅以内皮生长培养基-SingleQuots。在所有检测中，晚期EPC都是在第3期（约28天）用培养基完全洗净后使用的。28天后，使用CD31、Tie-2受体（BD Biosciences）和激酶插入结构域受体（KDR）分别从健康人和CAD患者体内分离的EPC均在37°C和5%CO2的EBM-2培养基中培养，培养基每48小时更换一次。

体外晚期EPC血管生成：

采用Matrigel管样形成试验测定EPC的血管生成能力。将Matrigel和EGM-2培养基在37°C、5%CO2条件下在96孔板中聚合1小时。每个条件组包含3个孔。最后观察细胞，用光学显微镜拍摄图像。用ImageJ软件评估网络面积和长度。同样，用基因转移技术和siRNA处理酸处理的EPC，然后进行Matrigel实验。

体外EPC迁移的后期：

EPC迁移是通过伤口愈合试验确定的。在6孔培养皿中培养2×105个P2代EPC。用p20移液管吸头手动刮除细胞单层，用PBS溶液清洗一次，然后加入2毫升EBM-2，形成伤口。在37°C下培养24小时后，计数移行的细胞。同样，用基因转移技术和siRNA处理酸处理的EPCs，然后进行伤口愈合实验。

酸刺激：

为制备等压pH培养基，首先用7.5-mM HEPES缓冲EGM-2，然后用pH微电极（Unisense，丹麦奥胡斯）测量培养基的pH值，用NaOH或HCl调节到所需的pH值。为制备合适的培养基，常规EGM-2培养基在含5%CO2或20%CO2的湿润组织培养箱中培养至少1小时。之后，测量每种培养基的pH值，分别约为7.4和6.4。

EPC基因转移：

培养28天后，用编码人GPR4基因的pcDNA3.1(+)（pcDNA3.1(+)-GPR4）、载体（pcDNA3.1(+)H302）或增强型绿色荧光蛋白基因（H312 pEGFP-N1）转染细胞。H312 pEGFP-N1仅用于荧光显微镜检测转染效率。经Western印迹和后续实验确定，pcDNA3.1(+)-GPR4或载体均不含增强型绿色荧光蛋白基因。用pcDNA3.1(+)-GPR4、载体（pcDNA3.1(+)H302）或H312 pEGFP-N1在无血清培养基中转导人EPC90分钟。转导后，用PBS冲洗细胞并用酸性培养基培养6小时，然后用于后续实验。

siRNA转染：

使用Lipofectamine®RNAiMAX试剂按照生产商的方案用5μlGPR4-siRNA或5μlscramblesiRNA转染EPCs48小时，然后用酸性培养基处理。转导后，用PBS冲洗细胞并用酸性培养基培养6小时，然后进行后续实验。