通过测量麦汁样品在加热到60°C时消耗溶解氧的能力，也检查了麦汁样品的氧化稳定性（图5）。早期麦汁样品消耗氧气的速率高于糖化结束时收集的麦汁。这与基于ESR的自旋捕获方法观察到的相对氧化稳定性一致，因此证明添加乙醇和自旋捕获剂POBN不会引起麦汁样品氧化行为的重大变化。麦汁样品在60°C时消耗氧气很快。在耗氧量测量前预热样品会导致测量开始时样品的氧含量水平差异很大。因此，最可重复的结果是在将室温麦汁样品加入预热的氧测量室时开始测量获得的。然而，这导致了在样品温度达到60°C的前10分钟测量期间观察到的氧气浓度迅速变化（图5）。

还测试了早期麦汁样品在培养过程中较高的自由基形成速率是否是由于存在内源麦芽氧化还原活性酶。脂氧合酶（LOX-1和-2）在高于65°C的温度下失活，预计在应用的糖化程序的最后一步中失活。在评估氧化稳定性期间，在70°C下培养麦汁样品，所有样品的自由基形成速率大约提高了四倍。然而，在两种培养温度下，来自糖化早期低温阶段的麦汁样品都比后期高温糖化阶段的样品显示出更高的自由基形成速率（图4）。这表明早期样品较低的氧化稳定性很可能不是由麦芽氧化还原活性酶的作用引起的

在麦汁样品培养期间的作用。然而，有可能在糖化的早期低温阶段，氧化还原酶产生了在麦汁加热时产生自由基的前体。在这种情况下，这些潜在的前体可能在糖化的最后高温阶段被破坏，从而产生在ESR评估自由基形成期间加热时不易产生自由基的后期麦汁样品。

糖化过程中添加铁：对麦汁样品中铁和铜水平的分析表明，最终麦汁比糖化25分钟后收集的麦汁含有更少的铁和铜（表1）。过渡金属，特别是铁和铜的存在，可以促进金属催化的氧化，从而降低氧化稳定性。在醪液开始时添加铁并不影响麦汁样品中自旋加合物的形成（图6），但在糖化和过滤后直接将铁添加到麦汁中显著增加了自旋加合物的水平。

麦汁样品中的铁浓度分析表明，在糖化过程中添加铁仅略微增加了麦汁中的铁水平，而直接向麦汁样品中添加金属则显著提高了铁浓度（表1）。这些结果表明铁在糖化过程中被有效结合。

过氧化氢酶和超氧化物歧化酶：过氧化氢和超氧化物是啤酒氧化过程中重要的中间体。过氧化氢酶能有效去除过氧化氢，并且已证明向啤酒中添加过氧化氢酶可抑制自由基的形成。向麦汁样品中添加过氧化氢酶（6000 CIU/L）导致自由基形成速率显著降低了20%（p<0.05）（图7）。正如预期的那样，添加过氧化氢显著增加了自由基的形成（图7）。同时添加过氧化氢和过氧化氢酶降低了自旋加合物的形成速率，证明过氧化氢酶在麦汁样品培养使用的高温（60°C）下是有效的。同样检查了超氧化物歧化酶的效果。尽管如此，单独添加超氧化物歧化酶或与过氧化氢酶联合添加，与对照相比，对自由基形成速率均未产生显著的正向或负向影响（p>0.05）（图8）。当超氧化物歧化酶与显著较低剂量的过氧化氢酶（200 CIU/L）联合使用时缺乏效果可能是原因。在低过氧化氢底物浓度下，如果存在合适的受体（如有机底物），过氧化氢酶能够充当过氧化物酶。这是由于过氧化氢酶和过氧化物酶对过氧化氢的亲和力存在巨大差异。过氧化氢酶在低底物浓度下充当过氧化物酶的可能性或许可以解释为什么

在明显较低剂量范围内没有观察到过氧化氢酶的效果。

讨论

通过测量甜麦汁样品在有空气接触加热过程中自由基形成的倾向来评估其氧化稳定性。自由基通过自旋捕获技术检测。然而，乙醇的存在对于积累浓度足以产生足够强度ESR信号的自旋加合物是必要的。乙醇对麦汁中自旋加合物形成的影响表明，在麦汁加热过程中形成了高活性自由基，如羟基自由基和烷氧基自由基。这些自由基能够与乙醇反应生成1-羟乙基自由基，后者被POBN捕获（反应1-3）。

因此，在自旋捕获实验中使用乙醇不仅增加了ESR可检测的自旋加合物的形成，而且使得对高活性自由基的检测更具选择性。此外，加合物{}^{bullet}POBN/CHleft(CH_{3}right)OH良好的热稳定性允许在麦汁高温培养过程中积累相对高浓度的该自旋加合物，从而产生高强度的ESR谱图。在无乙醇情况下观察到的ESR谱低强度不太可能是由于麦汁中缺乏自由基形成。在没有乙醇的情况下，非选择性的羟基和烷氧基自由基仅与麦汁中存在的碳水化合物、蛋白质、多酚和其他有机成分反应，但这些化合物衍生的自由基显然不形成自旋加合物，或者形成的自旋加合物不如乙醇衍生的加合物稳定。羟基自由基与碳水化合物的反应通常不具有选择性，可能导致多种产物，包括解聚和开环产物。

已证明氧是自由基形成所必需的。酶促反应，如脂氧合酶活性，在本研究麦汁加热过程中发生的氧化过程中很可能作用可忽略，因为它们在高于65°C的温度下失活。生物系统中羟基和烷氧基自由基的产生通常与铁和铜离子的存在密切相关，这些离子能够通过芬顿反应（反应4）将过氧化物转化为这些自由基。

有机过氧化物ROOH（如蛋白质过氧化物）可能通过类似反应与Fe(II)反应，产生烷氧基自由基（反应5）。

相应地，向麦汁样品中添加Fe(II)确实增加了自旋加合物的形成。值得注意的是，在糖化开始时添加铁并没有增加麦汁样品中的铁含量。显然，麦汁中的高铁含量通过其与固形物的有效结合而被阻止检测到，这些固形物在糖化室的过滤或压滤过程中被去除。

羟基和烷氧基自由基的形成表明过氧化物作为前体存在于麦汁中。因此，向麦汁中添加过氧化氢增加了自由基的形成，而过氧化氢酶（即使在麦汁培养使用的高温下也能非常有效地去除过氧化氢）能够阻止由添加过氧化氢引起的额外自由基形成。然而，在麦汁培养期间单独添加过氧化氢酶对麦汁中自由基的形成速率有显著影响，将其降低了20%。这表明以过氧化氢为试剂的芬顿反应（反应4）并非麦汁中氧化事件唯一的反应机制。此外，添加SOD对麦汁中的自由基形成没有正向或负向影响，这表明超氧化物在有氧氧化过程中不是重要的中间体。

两种机制可能解释自由基的形成无需游离过氧化氢或超氧化物作为中间体。有人提出，高活性氧酰离子（ferryl ions）Fe^{IV}=O可以通过氧作为双铁-氧络合物结合（反应6-8）的机制产生。已经表明，过氧化氢酶和SOD仅能部分防止铁自氧化过程中氧化物种的形成。这些物种中的一些，非常可能包括氧酰离子Fe^{IV}=O，取决于存在的螯合剂，能够将乙醇氧化成1-羟乙基自由基，后者已被检测为自旋加合物。

可以提出另一种机制，其中源自有机化合物（如碳水化合物或蛋白质）的烷基自由基捕获氧气形成过氧自由基（反应9）。麦汁中还原性化合物（如多酚）的存在导致过氧自由基快速转化为氢过氧化物（反应10），后者是形成烷氧基自由基的前体（反应5）。烷氧基自由基随后与碳水化合物或蛋白质反应，形成新的烷基自由基（反应11）。

根据目前的结果，无法区分这些机制。然而，这两种机制很可能并行发生，其中通过反应6-8产生的氧酰离子与碳水化合物或蛋白质反应，形成捕获氧气（反应9）的烷基自由基。

麦汁样品加热后立即形成自由基，这与贮藏啤酒（lager beer）形成对比，后者通常观察到自由基形成前有一个滞后期。贮藏啤酒风味稳定性与这些自由基形成滞后期长度之间存在良好的相关性。滞后期被认为是由于促氧化成分和抗氧化剂（如亚硫酸盐）的竞争效应所致。啤酒中的亚硫酸盐可以有效淬灭过氧化物，而过氧化物是自由基形成的重要前体。麦汁中自由基形成缺乏滞后期，表明麦汁中的内源抗氧化剂仅能淬灭一部分自由基，留下大量自由基参与有害的氧化反应。在麦汁过滤（mashing-off）时向麦汁中添加亚硫酸盐未观察到自由基形成的滞后期，表明亚硫酸盐在麦汁中会快速衰减。

在本研究中，使用甜麦汁中自旋加合物形成的初始速率来量化和研究糖化过程中氧化反应的发生程度。然而，需要进一步研究来评估啤酒酿造早期步骤中氧化的影响如何受到后续酿造步骤的调节，最重要的是，它们如何影响最终啤酒产品的质量。这包括进一步研究过氧化氢酶促进的甜麦汁自旋加合物初始形成速率降低对最终啤酒风味稳定性的影响。