麦汁ESR强制老化测试：麦汁样品（25.0毫升），含有5%（体积/体积）乙醇（96%纯乙醇，丹麦蒸馏厂，奥尔堡，丹麦）和POBN[α-4-吡啶基-1-氧化物-N-叔丁基硝酮，Aldrich,St.Louis,MO]，在密闭的蓝盖瓶（250毫升）中于室温下搅拌10分钟，以使反应物溶解。瓶子内有足够的大气空气顶部空间。将瓶子转移到预热的水浴（T=55°C）（Heto Laboratory Equipment,Allerod,Denmark）中。在给定的时间间隔取出样品（50μL）。使用Miniscope MS 200 X波段光谱仪（Magnettech,Berlin,Germany）记录麦汁样品的ESR光谱，使用50μL微量移液管作为样品池（Brand GMBH,Wertheim,Germany）。使用的设置如下：微波功率，10 mW；扫描宽度，95.9 G；调制频率，1000 mG；接收增益，900；扫描时间，60秒。所有光谱（单次扫描）均在室温下记录。光谱的振幅以中心双峰的高度相对于TEMPO水溶液（2μM）ESR信号中心线的高度进行测量和报告。TEMPO标准品在当天第一个和最后一个样品时进行测量。所有样品均进行三次重复测量。麦汁样品的氧化稳定性通过自旋加合物形成的初始速率来量化，该速率由在强制老化期间自旋加合物浓度初始上升阶段（在自旋加合物浓度开始趋于平稳之前）的线性回归确定（图3）。

加热麦汁的耗氧量：将室温麦汁样品转移到4毫升测量室（MR-Chamber,Unisense,Aarhus,Denmark）中，不留空气顶部空间。将装满的测量室置于预热的水浴（T=60°C）（Heto Laboratory Equipment,Allerod,Denmark）中。测量室配备克拉克电极（Unisense NR-sensor,Aarhus,Denmark），并立即开始测量。通过氧分析仪（Picoammeter PA 2000,Unisense,Aarhus,Denmark）每10秒记录一次氧浓度。测量前使用两点校准（60°C空气饱和水和60°C的0.1 M抗坏血酸钠在0.1 M NaOH溶液中）来校准电极和氧分析仪。

添加铁的醪液和麦汁的ESR强制老化测试：从新鲜制备的FeSO4（Merck,Darmstadt,Germany）水溶液储备液中，将最终浓度为50μM的FeSO4添加：(i)在糖化开始时，即麦芽与水混合时，添加到醪液中；或(ii)添加到糖化和过滤后获得的麦汁中。对糖化25分钟和125分钟后收集的麦汁样品进行ESR强制老化测试。

金属分析：使用原子吸收光谱法（Perkin-Elmer 3300,United States）测定在糖化开始25分钟和125分钟后收集的麦汁样品中的Fe和Cu浓度。比较了向麦汁样品中添加50μM FeSO4：(i)在糖化开始时添加；(ii)在糖化和过滤后添加到麦汁中；以及未添加FeSO4的对照麦汁。

过氧化氢、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的影响：将过氧化氢（30%，Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany）、过氧化氢酶（E.C.1.11.1.6，来自Scytalidium thermophilum的纯酶，无葡萄糖氧化酶副活性，Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark）或牛超氧化物歧化酶（E.C.1.15.1.1）（Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany）在添加乙醇和POBN之前立即添加到冷藏的麦汁样品中，并按上述方法进行ESR强制老化实验。一个过氧化氢酶单位（CIU）对应于在pH 7和30°C下每分钟分解1μmol过氧化氢的酶量。CIU通过分光光度法测定，评估在30°C、50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，过氧化氢酶在240 nm处去除H2O2的情况[ε=39.4 M⁻¹cm⁻¹]，将在240 nm处吸光度从0.450（H2O2起始浓度为10.3 mM）降至0.400所需的时间（秒）转换为每克酶产品的CIU。一个超氧化物歧化酶单位（SODU）将在偶联系统（含黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶）中，在pH 7.8、25°C、3.0 mL反应体积下，使用引起550 nm处吸光度变化率为0.025每分钟的黄嘌呤氧化酶浓度，抑制细胞色素c还原速率的50%。

统计分析：使用SAS JMP 6.0.0软件包（SAS Institute,Inc.,United States）进行统计分析。通过方差分析确定主效应的显著性。使用最小显著差异（LSD）检验识别平均值之间的显著（p<0.05）差异。

结果

甜麦汁的氧化稳定性：麦汁的氧化稳定性通过一种基于ESR的方法进行研究，该方法类似于评估啤酒风味稳定性的既定方法。将自旋捕获剂添加到糖化不同阶段收集的麦汁中，通过ESR检测在有空气接触加热过程中形成的自旋加合物。单独使用自旋捕获剂POBN得到ESR可检测的信号，这些信号随时间增加但振幅非常低（图2）。同时添加乙醇和自旋捕获剂显著增加了信号的振幅，正如Franz和Back先前所示。在乙醇存在下形成的POBN自旋加合物具有超精细耦合常数（aN=15.5 G和aH=2.5 G），与1-羟乙基自由基形成的自旋加合物的预期值相似。在无乙醇情况下形成的弱ESR信号具有非常相似的超精细耦合常数（aN=15.3 G和aH=2.6 G），这表明捕获的是碳中心自由基。

在所有甜麦汁样品中，自旋加合物的形成没有初始滞后期，并且在样品长时间加热过程中形成的自旋加合物量趋于平稳。然而，不同麦汁样品之间的形成速率和形成的自旋加合物水平存在差异。在氮气气氛下加热麦汁样品几乎完全阻碍了自旋加合物的形成（数据未显示）。这表明自旋加合物的形成与麦汁中的氧化反应密切相关。自旋加合物的形成预计是导致自由基形成的促氧化效应与淬灭自由基的抗氧化效应之间竞争的结果。因此，麦汁样品的氧化稳定性通过自旋加合物形成的初始速率来量化，该速率是在强制老化期间自旋加合物浓度初始上升阶段，在自旋加合物浓度开始趋于平稳之前确定的（图3）。在抗氧化防御能力低（阻碍氧化过程）和/或促氧化成分水平高（有利于自由基形成）的麦汁样品中，预计自由基形成的初始速率较高。无论哪种情况，与产生低自旋加合物形成速率的样品相比，该麦汁的氧化稳定性预计会受损。

糖化过程中甜麦汁的氧化稳定性：在糖化程序的不同阶段收集麦汁样品，并通过自旋捕获方法评估其氧化稳定性。通常，来自糖化初始低温阶段（投料）的麦汁样品比后期高温阶段的样品显示出更高的自旋加合物形成速率（图4）。当糖化温度升高时，观察到自旋加合物形成速率的明显变化。这种变化也与收集的麦汁样品中浸出物含量的变化相吻合（图1）。因此，通过比较添加蔗糖增加溶解有机物含量后的麦汁样品的自旋加合物形成速率，检查了麦汁样品中浸出物水平对自旋加合物形成速率的影响。当糖化25分钟后收集的麦汁密度（8.4°Brix）通过添加蔗糖加倍（17.8°Brix）达到与糖化后期麦汁相当的浸出物含量时，自旋加合物的形成速率仅下降了24%。将麦汁密度增加到32°Brix并未导致自旋加合物形成速率的进一步降低（数据未显示）。这表明蔗糖可能在一定程度上充当自由基清除剂。因此，与后期阶段相比，糖化早期阶段观察到的自由基形成增加不能完全用°Brix的差异来解释。另一方面，在糖化过程中温度升高期间，醪液中发生了许多其他化学变化，例如淀粉的糊化和糖化、蛋白质的水解和变性、以及涉及脂质、蛋白质、多酚和碳水化合物的众多氧化反应。