3.2缓慢生物降解的皮下镁植入物对H2的透皮感应

图3、AZ31植入皮下1周后，对麻醉裸鼠进行H2测量。(a)标有测量点并编号的小鼠照片。(b)与(a)中编号点相对应的瞬间电流反应。(c)根据校准曲线测定的各点H2浓度。BL是在空气中的测量值。(d)AZ31(N=3)在为期8周的研究期间每周监测的H2浓度。每只小鼠以植入物正上方为中心进行一次测量。

我们还研究了一种腐蚀速度较慢的镁合金AZ31，它产生H2的速度太慢，无法形成明显的空腔。如图3a所示，在小鼠身上看不到H2气穴，只有一个凸起显示植入的镁圆盘的轮廓。没有气穴证实了AZ31的生物降解比Mg8H慢得多。图3b-c显示了与Mg8H合金类似，从头部到尾部以及整个植入区域的各种测量点的实时传感器响应和氢含量。重要的是，植入的AZ31降解产生的H2通过皮肤渗透，尽管电流水平低得多，但H2微型传感器仍然可以轻松测量。从图3b-c可以看出，通过植入物中心正上方皮肤的H2浓度最高。

虽然植入物附近边缘区域的H2浓度较低，但仍能获得可测量的信号。在植入的AZ31(6号点)中心上方的皮肤上，电流高达171pA(36.4μM)；5号点和7号点的电流分别降至66pA(29.6μM)和62pA(29.2μM)。随着与植入物距离的增加，检测到的H2浓度降低。在头部区域(点1)，检测到的H2浓度很低，与未植入任何生物降解植入物的小鼠血液中的浓度相似。同样，在点2-4和点8-9检测到的H2浓度也很低。从这些测量结果中可以清楚地看到，尽管H2的浓度很低，但即使没有观察到气泡，也能检测到H2通过皮肤的渗透。这一观察结果表明，H2在皮肤中的传输速度非常快。它还证实，即使在看不到气穴的情况下，植入物降解过程中也会释放出H2。

在合金保持植入状态的2个月期间，采用与上述Mg8H相同的程序对H2含量进行了监测。图3d中的结果显示，与Mg8H(图2d)相比，2个月内H2浓度的下降幅度相对较小。尽管降幅较小，但使用学生t检验进行的统计评估显示，在95%的置信水平下，第一次和最后一次测量结果之间存在显著差异。这表明在2个月的时间里，腐蚀速率始终如一，只是逐渐降低。与Mg8H相比，AZ31的腐蚀速度较慢，因此H2浓度的下降幅度较小。由于AZ31在腐蚀过程中产生的H2气体要少得多，因此没有必要每周释放气泡。此外，与腐蚀速度较快的Mg8H样品相比，AZ31样品上的Mg(OH)2和MgCO3腐蚀层要薄得多。

3.3生物降解非常快的皮下镁植入物对H2的透皮传感

为了进行比较，还对腐蚀速度极快的合金ZK40进行了研究。如图S2所示，更快的腐蚀速度会释放出更多的H2，从而导致传感器发出更高的信号。在ZK40中，气泡中心的H2传感器电流高达620pA(360μM)，远高于类似位置的AZ31(171pA，36.4μM)。气泡边缘区域的H2传感器电流也较高，ZK40和AZ31分别为249pA(197μM)和121pA(140μM)。

图S2d显示了2个月期间ZK40的H2浓度。与植入后第一周相比，ZK40的H2浓度在8周前下降了近75%。这种腐蚀速度最快的合金显示出最高的H2初始浓度和8周内最大的降幅。

比较三种合金，三种合金在研究开始时产生的最大H2浓度和2个月期间H2的减少百分比都按照ZK40>Mg8H>AZ31的顺序减少。这与根据重量损失确定的腐蚀速率一致。此外，对于腐蚀速度较快的植入物来说，取出的合金上的沉淀层要厚得多。

根据这些使用不同合金的小鼠的实验结果，可以看出腐蚀速度较快的镁植入体在一定时间内产生的H2更多，导致空腔尺寸更大，电极测量到的植入体上方小鼠皮肤中渗透的H2浓度更高。因此，H2电化学传感器似乎可以通过无创程序检测不同镁合金在体内的相对生物降解率。

3.4 H2电化学传感器测量与腐蚀速率的相关性

图4、三种合金在植入2个月后重量减轻百分比与植入第一周后氢电极在体内测得的最大H2浓度的相关性。误差为三只小鼠(N=3)测量值的标准偏差。

为了确定H2微电极的测量结果与合金腐蚀速率的相关性，我们根据植入2个月后的重量损失来确定实际腐蚀速率。图4显示了氢气微电极在空腔中心或植入样品正上方测得的最大H2浓度与重量损失的比较。重量损失测量结果表明，2个月期间的腐蚀速率顺序为ZK40>Mg8H>AZ31，ZK40的生物降解速度比AZ31快得多。ZK40、Mg8H和AZ31的重量损失分别为75.0%、32.5%和2.4%。从图中可以看出，测得的最大H2浓度与重量损失百分比成正比，这在意料之中，因为生物降解率越高，产生的H2就越多。图4所示的H2测量值是在植入一周后记录的。与研究期间其他时间的测量结果相比，此时进行的测量结果与H2水平和重量损失之间的相关性最好。这种方法避免了以下并发症：每周例行从空腔中释放气体以缓解小鼠的不适感；两个月内由于植入体表面形成Mg(OH)2和MgCO3腐蚀层而导致的腐蚀速度减慢；植入体的质量(尤其是腐蚀速度较快的合金)减小；以及由于时间安排问题而导致的测量时间间隔的变化。

作为动物实验方案的一部分，每周都会测量气腔的大小。气腔体积是根据使用游标卡尺测量的皮肤表面尺寸估算的。然而，气腔体积与传感器获得的H2浓度之间的相关性很差。我们将此归因于气腔中的H2每周都会释放，以保证试验动物的舒适度。

总的来说，随着腐蚀速度的减慢，H2浓度在研究过程中会逐渐降低。在整个研究过程中，缓慢腐蚀的AZ31所测得的H2含量每周都相对稳定，而快速腐蚀的ZK40合金的H2含量则从研究开始到研究结束(大部分镁已腐蚀)大幅下降。

4总结

由于H2通过皮肤的传输速度非常快，因此可以在小鼠皮下植入的生物降解镁样品上方的皮肤表面经皮测量H2的浓度。虽然浓度很低(在这些研究中约为30-400μM)，但电化学H2微电极的检测限足以轻松测量这些浓度。测量非常迅速，氢气微电极只需约30秒就能达到稳定读数。测量到的H2含量与植入2个月后的样本重量损失所确定的腐蚀率相关。因此，H2微电极有望成为监测体内镁合金生物降解的有效手段。与传统的生物降解率监测方法(如取出样品的重量损失、X射线测量和显微CT)相比，氢气电极具有优势。与失重法相比，它可以测量当时的生物降解率，而不是整个植入过程中的综合生物降解率。与X射线和显微CT相比，该仪器的成本要低得多，而且不会受到辐射。经皮感应H2的主要基本限制是H2从植入物到皮肤表面的最大组织深度，即H2可以渗透到足够高的浓度，从而通过将微电极尖端按压到皮肤上进行检测。因此，这种技术可能不适用于大腿骨等深层植入物，因为在深层植入物中需要通过厚厚的肌肉层进行渗透。由于动物的身体差异，适用性也会有所不同。实际考虑因素包括需要以适当的间隔用H2标准定期校准微电极，以确保测量的准确性。此外，H2微型电极的膜渗透性会随着时间的推移而发生变化，导致灵敏度在几个月内下降高达50%。

总之，这些结果为常规H2测量奠定了基础，可作为镁制设备体内测试的一部分。H2微电极可快速测量植入物(如用于修复断臂、手腕、腿、脚踝、脚或下颚的钢板)生物降解过程中产生的透皮H2水平，因为金属直接位于测试动物的皮肤下。

该技术在人类患者身上的应用取决于H2必须通过的植入物上方生物组织的深度和渗透性。人类皮肤一般比小鼠皮肤厚，渗透性也较差。小鼠皮肤(表皮和真皮)的厚度约为200-500μm，在某些部位，如眼睑和颈部(380-700μm)，与人类皮肤的厚度接近。人类皮肤的表皮平均厚度为83.7μm，而小鼠皮肤仅为9.4-13.3μm；人类皮肤的真皮平均厚度为908-1339μm，而小鼠皮肤仅为200-500μm。主要的渗透屏障是最外层，即角质层。

如果我们根据啮齿类动物角质层对低分子量溶质的渗透性比人类角质层高3-4倍这一常见的经验法则，并进一步假设人类皮肤和小鼠皮肤的毛细血管和淋巴管通畅度相当，那么初步估计，植入物刚好位于皮肤表面下方的人类受试者皮肤表面的H2逸出率将比在小鼠身上观察到的低3-4倍。这一预测表明，使用现有的H2微电极仍然可以测量到H2。由于这一估计值包含多个假设，因此值得进行实验验证。因此，预计经皮H2测量对于直接植入皮下(如手背和脚背、手指和脚趾等附属器官以及手臂等接近表面的骨骼部位)是有效的。对于较深的植入物，特别是H2必须通过肌肉与血管渗透的地方，H2的反应会减弱，而血管会将H2带走。这种方法具有无创的特点，而且操作简单，因此可用于对人体皮肤附近植入物的生物降解率进行护理点测量，作为愈合过程中医生办公室例行检查的一部分。