2实验方法

2.1植入材料。

镁合金ZK40(含Mg-4wt%Zn-0.5wt%Zr-1.4wt%Cu0.2wt%Fe-0.3wt%Mn-1.8wt%Ni-0.7 wt%Si)是通过之前描述的方法制备的。含2.5-3.5wt%Al、0.6-1.4wt%Zn和0.2-1.0wt%Mn(其余为Mg)的AZ31合金购自Goodfellow。合金的加工方法基于之前的方法。高纯镁单晶Mg8H的典型制备方法如下。主要工具是CVD设备公司制造的晶体生长器。纯度为99.95%的初始多晶镁被用作生长单晶的原料。使用一个锥形石墨坩埚来盛放熔融材料，坩埚外部的支架由特殊等级的不锈钢制成。生长过程在氩气流下的垂直石英管中进行。石英管周围是一个垂直晶体炉。熔炉有两个温度区，以便在坩埚中形成并控制适当的温度梯度。熔体浸泡8小时，以实现完全均化。之后，在适当的热梯度下，通过控制炉腔的退出，从熔体中生长出单晶体。这种技术被称为布里奇曼-斯托克巴格方法。本研究使用了一个典型的镁单晶体，其长度为45毫米，直径为6.5毫米，取向接近(0001)。通过放电加工(EDM)将晶体切割成直径5毫米、厚度2毫米的圆盘。在异丙醇中使用600粗细度和1200粗细度的碳化硅纸对圆盘进行手工抛光。每次抛光后，将单个圆盘在乙醇中超声2分钟，然后风干。

2.2实验室小白鼠操作规程。

特异性无病原体雌性无胸腺裸鼠购自哈兰实验室，在8-10周龄时使用。为了探索宿主对AZ31、ZK40和Mg8H样品的急性反应，进行了一项体内小鼠皮下研究。小鼠植入试验在辛辛那提大学进行(3只小鼠/样品类型)。在该试验中，从AZ31、ZK40和Mg8H合金样品中切下直径为5毫米、厚度为1.4毫米的圆片。然后将圆盘样品在丙酮中超声并风干。灭菌时，将颗粒在70%的乙醇中浸泡5分钟，用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，KCl2.7mM，KH2PO4(1.5mM)，NaCl(138mM)，无水Na2HPO4(8.1mM)，pH7.0)冲洗，然后在紫外线下照射圆片两侧各20分钟。将健康的裸鼠饲养在受控条件下，并提供标准饮食和水。用异氟烷对所有小鼠进行麻醉，然后在小鼠背部做一个小的皮肤切口，形成一个皮下口袋。将镁合金插入袋中，然后用手术钉缝合切口。两个月后，小鼠在二氧化碳环境下被处死，并取出合金以进行进一步表征。

2.3用H2安培传感器测量H2。

使用H2微电极(尖端直径50μm，H2-50)连接万用表(Unisense)，在+1000mV下极化至少1小时后，进行安培H2测量。在进行每一系列测量之前，都要按照制造商的建议对H2微型传感器进行校准。校准时，在水中通入高纯度H2气体，直到H2达到饱和。然后，用去离子水将饱和H2水溶液稀释到不同浓度。对于每种溶液，根据饱和百分比(0%、20%、40%、60%、80%和100%饱和溶液)进行6次测量。稳态电流根据每次测量的稳态信号数据点的平均值计算得出。氢饱和水在室温下为0.8mM；因此，稀释后的含氢溶液是根据其饱和度百分比计算的。每次测量时，将氢传感器尖端浸入H2校准液中3分钟，绘制电流与H2浓度的校准曲线。根据校准图将体内测量值转换为H2浓度。

在体内测量时，使用微型机械手定位微型传感器。测量方法是将微电极尖端触碰气腔上方靠近植入区域的皮肤，以及图中所示的其他位置。作为对照，在远离气腔的区域(如尾部)的皮肤上进行测量。利用从已知的H2饱和水含量生成的校准曲线，将从H2传感器获得的电流转换为H2浓度(见上文)。

2.4 H2微电极用于小鼠皮下镁植入物H2的透皮感应。

使用电化学传感器检测H2，在工作电极上施加恒定电位，测量产生的电流(安培传感器)。氢在传感器内部的铂电极上通过电化学氧化成质子而被检测到：H2→2H++2e-。

微电极的顶端非常小(直径50μm)，因此可以在一个精确的点上进行测量。顶端有一个硅橡胶膜塞，H2通过硅橡胶膜塞才能被检测到。这一特点使传感器对H2具有极高的特异性。其检测限(0.01%，水中0.1μM)非常低，足以轻松测量这些实验所涉及的极低浓度的H2。

使用该微电极进行每次体内测量时，都要用图1所示的可精确调节的微型定位器将微电极尖端轻轻按压在麻醉小鼠的皮肤上。这一测量过程与我们之前的报告中描述的无创测量类似。每次测量大约需要30秒钟才能获得稳定信号。不过，为了获得最稳定的H2信号和更精确的测量结果，测量时间应为3分钟或更长。在进行每一系列测量之前都要对微电极进行校准，之后立即再次校准，以确保微电极的响应没有偏移。

3结果和讨论

3.1通过皮下镁植入物的生物降解介质对H2进行透皮感应

图2、植入多晶Mg8H皮下1周后，对麻醉裸鼠进行H2测量。(a)标有测量点并编号的小鼠照片。(b)与(a)中编号点相对应的瞬时电流反应。(c)根据校准曲线确定的各点测得的H2浓度。BL为空气中的测量值。(d)在对Mg8H(N=3)进行为期8周的研究期间，每周监测一次H2浓度。每只小鼠以植入物正上方为中心进行一次测量。

首先利用Mg8H多晶合金探索了透皮H2传感技术。这种合金的生物降解速度非常快，足以产生足够多的H2气体，在小鼠皮下植入时形成突出皮肤的可见气穴。这种合金的气穴在植入后24小时内就变得清晰可见，并逐渐增大，直至变得相当大。所有合金在植入后每周进行一次H2测量(见下文)。图2a显示了一只裸鼠在植入Mg8H盘一周后的气腔情况。由于气穴尺寸非常大，出于对动物安定的考虑，气体在1周后被释放。

如图2a所示，在小鼠身上多个位置(空腔上、紧邻空腔处和远离空腔处)定位微电极尖端的反应如图2b所示。通过空腔顶部小鼠皮肤渗透的H2会产生大量信号，很容易被检测到。我们之前的研究表明，这些氢气水平代表了空腔内的H2浓度。在图2a所示各点测量到的H2浓度提供了H2通过皮肤渗透的"地图"。

噪声部分是由于H2安培传感器在小鼠皮肤上移动到不同位置时产生的运动造成的。每个测量点的电流平均响应通过校准曲线转换为电流中的H2浓度后，以图表形式显示在图2c中。误差为三只小鼠(N=3)测量结果的标准偏差(见下文)。正如预期的那样，当微电极针尖直接放置在种植体周围的空腔上时，H2含量最高(100-200μM)(3-6点和11-15点)。根据微电极尖端放置在腔隙上的具体位置，H2存在一定的差异。这种变化可能是由于气体膨胀导致的皮肤厚度变化或腔内部结构变化造成的，这在早些时候已有报道。

当氢气电极尖端移离空腔时，仍能从紧邻空腔的皮肤中检测到H2，但浓度要低得多(第16-17点)。对头部和尾部(第1、2和7-10点)的测量结果显示，信号略高于在空气中测量的空白值。在尾部和头部等远离植入物的地方测得的H2浓度较低，为1.0-7.3μM，这是因为食物消化过程中的需氧细菌产生了背景信号。在未植入植入物的对照组小鼠体内测量的H2浓度显示，在所有测量点，包括在测试小鼠背部植入植入物的区域，H2浓度都非常低。对照组小鼠和距离植入物较远的测试小鼠体内的这一背景水平也与文献报告中1.0μM的氢浓度一致。这一观察结果表明，虽然氢气浓度很低，但通过血管系统运输到体内的氢气还是被检测到了。

为了测试腔体上特定点H2测量的可重复性，在使用和不使用显微机械手(手持)的情况下对同一点进行了H2测量。使用微型机械手进行的六次测量得出的平均值为261±17pA，而用手进行的四次测量得出的平均值为243±19pA。这些结果表明，特定点的H2测量值具有很高的重现性，手持测量的效果几乎与使用显微机械手测量的效果一样好。为了获得最佳精度，必须以可重复的方式将微电极尖端轻轻按压在小鼠皮肤上。由于H2在空气中的扩散速度较快，因此在微电极尖端略高于皮肤表面的情况下进行的测量得出的数值较低。这些结果表明，经皮检测H2确实具有可重复性。

这种检测体内生物降解的非侵入性方法的一个主要优点是能够对同一只动物在一段时间内进行重复测量。通过对三只小鼠(N=3)进行为期两个月的H2监测，证明了这一点。每周测量一次植入Mg8H上部皮肤中心的H2浓度。从图2d可以看出，前3周的H2浓度相似，然后随着时间的推移而降低。与第一周相比，8周时的H2浓度下降到50%。随着时间的推移，H2浓度下降的原因预计是Mg(OH)2和MgCO3在植入物表面形成了越来越厚的腐蚀层，导致腐蚀速度减慢。