结果：

1.疟原虫感染增加鼠伤寒沙门氏菌的肠道定植

在实验性疟疾模型中，如约氏疟原虫(以下简称疟原虫)，感染小鼠可改变肠道环境，降低对鼠伤寒沙门氏菌的定植抵抗力。然而，在感染后的较晚时间点，鼠伤寒沙门氏菌可以克服定植耐药性，因为它的毒力因子，两种III型分泌系统(T3SS-1和T3SS-2)，引发肠道炎症。为了从鼠伤寒沙门氏菌毒力因子对减弱定殖力的贡献中分离出并发疟疾的贡献，在接种疟原虫后的不同时间点，小鼠组被感染野生型鼠伤寒沙门氏菌或缺乏T3SS-1(由于invA突变)和T3SS-2(由于SpiB突变)的invASpiB突变体(如图1A所示)。当在疟原虫注射(DPP)后6天或更晚时，鼠伤寒沙门氏菌在感染疟原虫的小鼠的盲肠和结肠中定植的水平比对照小鼠高10到100倍(图1B，1C，S1A)。这与鼠伤寒沙门氏菌的毒力无关，因为野生型和invA SpiB突变体都显示出更强的定殖力(图3)。6-dpp时间点与疟原虫在血液中扩展的高峰期相关（图S2A）。此时，感染疟原虫的小鼠已持续出现严重贫血（图S2B），体重大幅下降（图S2C），而脾脏肿大在整个疟原虫感染过程中持续增加（图S2D）。因此，6天后疟原虫接种被确定为最早的可靠时间点，以研究疟疾相关定植抗性缺陷的根本原因，并被用作后续实验的主要模型。

2.硝酸盐和氧气相关生长对促进鼠伤寒沙门氏菌定植的影响

由于疟原虫感染期间招募的巨噬细胞通过硝酸盐呼吸作用促进共生肠杆菌的生长，而且先前的工作表明，疟原虫感染也会招募巨噬细胞到盲肠粘膜，因此我们假设，同时发生的疟疾可能会增加管腔内硝酸盐的供应量，从而促进伤寒杆菌的扩增。为了验证这一观点，我们用两种菌株1:1的混合物感染小鼠，比较了鼠伤寒杆菌野生型与缺乏硝酸盐还原酶活性的突变体（napA narG narZ cyxA突变体）的适应性。尽管共同感染组小鼠的肠道负担总体上有所增加，但硝酸盐呼吸的基因消减并没有降低伤寒杆菌在疟原虫感染小鼠中的适应性（图1D，E）。这一发现表明，在并发疟疾期间，硝酸盐的利用对于提高鼠伤寒杆菌的粪便恢复能力是不可或缺的。

另外，有研究表明，炎症也会通过增加氧气的生物利用率而使伤寒杆菌受益。通过伤寒杆菌毒力相关的炎症或服用抗生素来消耗梭状芽孢杆菌，会导致微生物群中短链脂肪酸（SCFA）丁酸盐的产生减少，而这种脂肪酸通常会促进负责维持管腔缺氧的结肠上皮细胞。丁酸盐供应量的减少会使结肠细胞的初级新陈代谢从氧气密集型的SCFA分解转向氧气密集型的SCFA分解，从而增加氧气向结肠腔的扩散。这为沙门氏菌和大肠杆菌等使用细胞色素氧化酶的兼性厌氧菌的生长提供了额外的呼吸电子受体。我们之前的研究发现，疟原虫感染会影响微生物群，包括粪便中的梭状芽孢杆菌相对减少，我们推测这可能是打开了结肠中的氧气呼吸生态位，促进了沙门氏菌的生长。为了验证这一观点，我们比较了鼠伤寒沙门氏菌野生型与缺乏高亲和力细胞色素bd氧化酶的突变体（cydA突变体）的适应性。然而，尽管cydA在受疟原虫感染的小鼠中提供了约10倍的体能优势，但在未暴露于疟原虫的小鼠中也观察到了类似的体能优势（图1F，G），这表明共同感染小鼠肠腔内氧的增加并没有导致鼠伤寒杆菌水平的升高。总体而言，这些结果表明，增加对呼吸电子受体的可及性是不是疟原虫感染期间定植抗性缺陷的主要促成因素。

3.疟原虫感染不会迅速增加肠道内鼠伤寒沙门氏菌的复制

疟原虫没有增强呼吸道生长缺陷，这让我们产生了疑问：在共同感染的小鼠中，定植抗性的降低是否与鼠伤寒杆菌的快速生长有关？为了评估这个问题，我们给小鼠接种了携带乳糖抑制质粒pAM34的鼠伤寒杆菌，该质粒可用于短期评估细菌在低乳糖环境（如成年小鼠肠道）中的生长情况。挑战24小时后，尽管共感染小鼠组的细菌定植量增加，但整个肠道的鼠伤寒沙门氏菌种群在疟原虫联合感染和模型感染的小鼠中显示出相同的复制率（图2A，B）。耐人寻味的是，我们发现共感染小鼠在受到挑战4小时后的伤寒杆菌定植率已经更高，这也与体内生长速度无关（图2C，D）。鼠伤寒沙门氏菌感染量的这种快速差异并没有伴随着复制的增加，这表明细菌的快速生长并不是造成疟原虫感染小鼠定植增强的原因。

4.约氏疟原虫感染影响胃的抗菌防御

由于小鼠接种疟原虫后，伤寒杆菌载量的差异很快就出现了，因此我们推测，疟原虫感染可能会损害了固有的对细菌定植的“瓶颈”防御，这种防御在病原体摄入后期起作用。我们还观察到，合并感染的小鼠在整个上消化道中往往表现出较高的鼠伤寒杆菌水平（图S3A），看来合并感染的小鼠对鼠伤寒杆菌定植抵抗力的丧失可能发生在胃或小肠中。

胃中的高酸性（pH值为1.5至3）环境是许多肠道病原体定植最严重的初始瓶颈之一。尽管鼠伤寒沙门氏菌在中性pH下生长旺盛，但在体外短期（60分钟）暴露于低至pH4的酸性环境中也能存活（图3A）。然而，接种的细菌在pH值为3.5或更低时迅速死亡，暴露于pH值为2.5或更低的培养基中的细菌无一存活（图3A）。包括致病性和非致病性在内的许多肠杆菌都具有类似程度的酸敏感性（图S4，A至E）。这一发现与之前的研究结果相吻合，表明伤寒杆菌和其他肠道病原体极易被胃中的酸性物质杀死。因此，胃酸维持不足可能导致摄入的鼠伤寒杆菌在肠道中存活率更高。

当使用pH感应微电极直接测量胃腔酸度时，与模拟感染小鼠（平均pH=2.46±0.32）相比，到6dpp时疟原虫感染与胃pH显著升高（平均pH=4.02±1.07）相关（图3B）。在感染疟原虫期间出现的低盐血症与定植抵抗力的丧失有关，因为在6dpp之前的小鼠中检测不到低盐血症（图S3B）。6dpp小鼠的胃普遍小于模拟感染对照组（图S5A），部分原因可能是进食量减少（图S5B），这与观察到的寄生虫感染期间体重下降模式一致（图S2C）。由于进食可刺激胃酸分泌，我们预测观察到的pH值差异是疟疾期间进食量急剧减少的结果。禁食模拟感染小鼠一夜足以减轻胃重量（图S5C），但与自由进食的喂养小鼠相比，禁食小鼠的胃pH值并没有改变（图S5D）。禁食也不能使禁食的模拟小鼠和感染了疟原虫的小鼠对接种的鼠伤寒杆菌的定植抗性恢复正常（图S5E），这表明在疟原虫感染期间，胃酸度和对鼠伤寒杆菌定植的易感性的缺陷不仅仅是食物摄入量的急剧下降。

5.疟疾引起的胃酸降低影响鼠伤寒沙门氏菌的定植

我们接下来想确定所观察到的低盐酸血症是否真的是合并感染的伤寒杆菌存活率增加的原因。胃酸分泌通常是通过对胃顶细胞的刺激信号和抑制信号相结合来调节的，从而导致胃质子泵转位到顶端膜并向胃腔主动分泌胃酸。最有效的分泌信号之一是组胺，它由胃腺中的肠石蜡样细胞在局部释放，与胃顶细胞的H2受体（H2R）结合。为了评估在感染疟原虫期间胃的高pH值是否是导致定植抵抗力缺陷的原因，在小鼠挑战鼠伤寒沙门氏菌前1小时用特异性H2R激动剂二盐酸地马普利特刺激胃酸分泌。给予H2R激动剂可使感染疟原虫的动物的胃pH值迅速降至模拟感染水平（图3C）。此外，在疟原虫感染的小鼠中，H2R刺激挽救了对鼠伤寒沙门氏菌的定植抗性（图3D，E），而不影响寄生虫感染，包括寄生虫血症（图S6A）和贫血（图S6B）。

在补充实验中，用质子泵抑制剂奥美拉唑治疗小鼠，以阻止胃酸分泌到胃腔，然后再进行鼠伤寒杆菌挑战。对照组小鼠接受奥美拉唑治疗后，胃pH值（图3F）和鼠伤寒杆菌定植（图3G和H）相对于接受药物治疗的小鼠都有所上升，这与之前观察到的结果相同。然而，与给予载体的疟原虫感染小鼠相比，给予奥美拉唑并不会进一步增加鼠伤寒杆菌的定植（图3G，H），也不会影响寄生虫感染的严重程度（图S6，C和D）。这表明，仅感染疟原虫对胃pH值的影响就足以最大限度地帮助接种细菌更好地在胃环境中生存。总之，这些数据表明，感染疟原虫的小鼠胃酸减少是导致其对伤寒杆菌感染易感性增加的原因，因为寄生虫相关的低盐血症是促进胃内接种细菌存活的必要条件，而胃酸减少反过来又会促进肠道定植。