如图3(C)所示，氧化石墨烯进入胚胎后，最初出现在胚胎周围，并选择性地定位在卵黄囊、心脏、眼睛和尾部；此外，它还富集在血管中。这与氧化石墨烯家族纳米材料主要在小鼠的肺、肝和脾脏中积累，并在血管中富集的报告一致。据报道，许多纳米粒子都会影响斑马鱼胚胎的早期发育，当胚胎暴露于AgNPs、SiNPs、CNTs和富勒烯时会导致畸形。在本研究中，观察到了三种典型的畸形，包括心包/卵黄囊水肿、尾部弯曲和眼睛/头部畸形，这与氧化石墨烯在胚胎中的定位一致。去除绒毛后，在用1mg/L氧化石墨烯处理的胚胎中也观察到了这三种典型的畸形，这表明氧化石墨烯可在斑马鱼胚胎发育过程中诱导畸形。此外，尾部/脊髓弯曲、心包/卵黄囊水肿和眼/头畸形的发生率随氧化石墨烯浓度的增加而增加；心包/卵黄囊水肿的情况尤其如此。然而，如上所述，胚胎中氧化石墨烯的积累并没有随着氧化石墨烯浓度的增加而增强。绒毛膜中的氧浓度随着氧化石墨烯浓度的增加而降低，这表明缺氧增强了氧化石墨烯的毒性。这些结果还表明，缺氧诱发的畸形具有选择性，通常在心包/卵黄囊(水肿)和头部观察到更多的畸形，这可能是因为心脏和大脑比其他器官对缺氧更敏感。有趣的是，尾部/脊髓弯曲的发生率最初随着氧化石墨烯浓度的增加而增加，后来随着氧化石墨烯浓度的增加而减少。这些独特的结果不同于之前用镉和二氧化钛纳米粒子得出的结果，后者会随着浓度的增加而持续增强尾部/脊髓弯曲。同样，与对照组胚胎相比，暴露于1毫克/升氧化石墨烯的胚胎的心率明显降低；但与对照组胚胎相比，暴露于100毫克/升氧化石墨烯的胚胎的心率却有所提高。在更严重的缺氧压力下，为了增加氧气供应，用100毫克/升氧化石墨烯处理的胚胎的心率增加了。纳米银颗粒或纳米磷颗粒没有观察到这一现象，随着其浓度的增加，心率会稳步降低。

细胞凋亡被认为是纳米材料的一种普遍不良影响，与各种疾病和毒性有关。氧化应激(包括ROS生成)是与氧化石墨烯相关的主要不良效应，被认为是细胞死亡的最可能机制。识别特定器官的细胞凋亡和ROS对于解释和理解相关疾病或不良反应(如心率异常和畸形)至关重要。在本研究中，ROS和细胞凋亡在氧化石墨烯定位的特定区域都有所增加，这表明氧化石墨烯的积累可能会导致斑马鱼胚胎发育过程中的氧化应激和细胞凋亡。

石墨烯能够通过激活线粒体途径诱导产生ROS并随后引发细胞凋亡，这支持了我们的结果，即细胞凋亡随着ROS的产生和线粒体的损伤而增加(图3和图6)。碳纳米管(CNTs)可能会在体内或体外导致ROS生成和毒性效应，这主要是由于表面缺陷的存在。同样，结构缺陷也被认为在石墨烯系列材料的毒性中起着重要作用，这主要是因为客体原子或分子具有很高的活性。此外，在本研究中观察到，氧化石墨烯具有锋利的齿状边缘(图1C)；因此，氧化石墨烯可能会通过直接的物理过程破坏线粒体膜并诱导产生ROS。据报道，这些锋利的边缘可直接使细胞、细菌和病毒的膜破裂，从而对生物体造成物理损伤。此外，缺氧环境还可能诱导产生过多的ROS和细胞凋亡，并改变动物和人类胚胎的能量代谢和自我更新。这些结果表明，在胚胎发育过程中产生ROS、导致细胞凋亡和诱发畸形的途径有很多。然而，ROS的产生与线粒体损伤密切相关，这主要是因为线粒体是斑马鱼胚胎中产生ROS的主要细胞器。

过量产生的ROS明显抑制了SOD的活性，增加了MDA的含量，造成了氧化应激。先前的研究表明，新生DNA链中鸟嘌呤的氧化损伤会抑制DNA甲基化，降低DNA甲基化水平。在本研究中，经1mg/L氧化石墨烯处理的胚胎的DNA整体甲基化水平显著降低，8-OHdG加合物的水平升高。DNA甲基化水平的降低可能会改变基因表达，从而导致发育异常，如畸形和细胞凋亡。因此，接触氧化石墨烯引发的异常DNA甲基化模式可能是氧化石墨烯对胚胎产生毒性的潜在机制。浓度为100毫克/升的氧化石墨烯会导致8-HOdG加合物和DNA甲基化水平升高，这意味着氧化石墨烯对胚胎的毒性机制是复杂的。

结论

氧化石墨烯特异性地包裹和渗透绒毛膜，导致绒毛膜缺氧，并在斑马鱼胚胎发育过程中产生毒性。包膜效应直接导致胚胎附近形成明显缺氧的微环境，氧化石墨烯对绒毛膜表面施加机械力。与此同时，胚胎的自发运动也减弱了，这也与氧化石墨烯的包裹作用有关。这些不利影响最终导致了斑马鱼胚胎发育过程中的孵化延迟。氧化石墨烯可诱导ROS、细胞凋亡、心包/卵黄囊水肿和尾部/脊髓弯曲，其作用与浓度有关。进入胚胎后，氧化石墨烯选择性地定位于卵黄囊、心脏、眼睛和尾部。氧化石墨烯会破坏线粒体，干扰抗氧化酶的活性，诱导ROS生成和脂质过氧化，并导致这些区域的细胞凋亡和畸形。此外，氧化石墨烯还诱导形成8-OHdG加合物，改变DNA甲基化。这项工作探讨了氧化石墨烯对胚胎发育的具体不利影响，并强调了氧化石墨烯对生态和健康的潜在风险。