讨论

绒毛膜是一种特殊的生物物质，在斑马鱼72hpf之前一直围绕着胚胎，它可以保护胚胎并充当防止与纳米粒子接触的第一道屏障。我们最近的研究表明，石墨烯基材料可直接与植物细胞表面的氨基发生相互作用；但对于绒毛膜来说，这种相互作用尚不明确。在本研究中，我们使用光学显微镜、扫描电镜和傅立叶变换红外光谱研究了氧化石墨烯与绒毛膜之间的相互作用。光学显微镜图像显示，氧化石墨烯吸附在绒毛和胚胎表面(图2)。形成的透明氧化石墨烯层覆盖了突起并包裹了绒毛，导致突起之间的孔道堵塞(图2B)。胚胎经1mg/L氧化石墨烯处理后，绒毛膜上的一些官能团发生了变化，例如，羟基和C=O基团的数量增加了，这表明氧化石墨烯在绒毛膜上的吸附可能是由于羟基之间的相互作用而发生的。

绒毛膜孔道的堵塞导致绒毛膜与培养基分离，进而影响胚胎发育。在本研究中，用氧化石墨烯处理的胚胎出现了孵化延迟、心脏功能障碍和畸形。然而，胚胎与环境隔离所产生的负面影响尚不明确。因此，我们测量了绒毛膜微环境的氧浓度和对胚胎的损害。随着氧化石墨烯浓度的增加，胚胎中逐渐形成了缺氧微环境，这与绒毛表面的孔被堵塞以及氧化石墨烯对绒毛的包裹程度是一致的(图2)。氧化石墨烯浓度为1毫克/升时，气孔未被堵塞，绒毛膜和胚胎附近的氧气浓度与对照没有显著差异(p<0.05)。然而，随着氧化石墨烯浓度的增加，堵塞程度增加，胚胎附近的氧气浓度明显降低(p<0.05)。最后，当胚胎暴露于100mg/L氧化石墨烯时，绒毛膜表面被完全包裹，绒毛膜附近区域和胚胎都明显缺氧(p<0.05)，这表明氧化石墨烯完全包裹后，胚胎发育所需的氧气供应不足。

这些数据表明，绒毛膜的缺氧程度随着氧化石墨烯浓度的增加而增加，且呈剂量依赖性(图2)。此外，去掉绒毛后，含有胚胎和氧化石墨烯的溶液中的氧气浓度与对照没有显著差异。这些数据表明，缺氧微环境主要是由于绒毛被氧化石墨烯包裹所致。有趣的是，靠近胚胎的绒毛膜中的氧浓度与胚胎在48hpf之前的自发移动有明显的正相关(R2=0.84)，这可能会影响随后的孵化。

先前的研究报告指出，当斑马鱼胚胎暴露于120毫克/升的单壁碳纳米管(SWCNTs)和3毫克/升的羟基磷灰石纳米颗粒时，会出现孵化延迟。相比之下，单壁碳纳米管在100毫克/升的浓度下不会影响斑马鱼胚胎的孵化。这些矛盾可能是由于纳米材料的理化性质和暴露水平的不同造成的，如它们的化学成分、纯度、尺寸、表面电荷、形状和结构。在本研究中，使用100mg/L含有0.02%S和0.01%K的高纯度氧化石墨烯处理的胚胎出现了孵化延迟。因此，对胚胎发育的负面影响主要归因于氧化石墨烯与生物体之间的相互作用。一般来说，孵化延迟可能是由于绒毛膜的弹性改变、孵化酶受到抑制、缺氧或自发运动减少造成的。氧化石墨烯片可对绒毛膜表面施加机械力，从而改变绒毛膜的弹性(图2B)。氧化石墨烯包膜还在绒毛膜中创造了缺氧微环境(图2C)，并诱导了孵化延迟。之前的研究表明，与暴露于常氧处理的胚胎相比，暴露于低氧环境的沙螺(Polinicessordidus)和黑鲷鱼(Acanthopagrusbutcheri)胚胎显示出孵化延迟。此外，与对照组相比，经100mg/L氧化石墨烯处理的胚胎在48hpf时的自发运动明显减少(图4C)，这是胚胎孵化延迟的另一个原因。此外，氧化石墨烯诱导心包和卵黄囊水肿，这可能干扰了孵化酶的活性(图4D)。虽然1毫克/升和10毫克/升的氧化石墨烯会诱发这些畸形，但这些浓度的氧化石墨烯并不影响斑马鱼胚胎的孵化，这表明在本研究中，孵化酶的紊乱并不是导致孵化延迟的决定性因素。

为了检查氧化石墨烯在胚胎中的迁移情况，使用氧化石墨烯-F进行了共聚焦显微镜观察。鉴于氧化石墨烯-F的荧光强度远高于游离的FITC，而且荧光强度随浓度的增加而线性增加，胚胎中的荧光信号应该是由于氧化石墨烯-F的掺入造成的。这一结果揭示了绒毛膜抵抗氧化石墨烯入侵的能力有限，石蜡切片、TEM和拉曼光谱的结果也证实了这一点(图3B-G)。氧化石墨烯渗透绒毛膜的机制仍不清楚。之前有报道称，银纳米粒子(5-46nm)可通过被动扩散穿过斑马鱼绒毛膜的孔道。TEM图像支持上述假设，即氧化石墨烯自发地通过被动扩散穿透绒毛膜，因为绒毛膜是一个无细胞包膜。然而，与银纳米粒子(NPs)不同的是，氧化石墨烯是通过独立的孔道穿透绒毛膜的，如图3(B)所示。

先前的研究表明，石墨烯或氧化石墨烯主要通过内吞作用内化到人体细胞中，并依赖于吸收。在本研究中，用1mg/L氧化石墨烯处理的胚胎中观察到了含有氧化石墨烯的囊泡(图3B3)，这支持了上述假设，表明氧化石墨烯是通过内吞作用被斑马鱼胚胎吸收的。在这项研究中，直径约为101到258nm(平均为147nm)的氧化石墨烯粒子适合被细胞吸收。然而，随着氧化石墨烯浓度的增加，氧化石墨烯在胚胎中的积累并没有增强。这一结果与Shang等人的报告不一致，他们认为石墨烯量子点(GQDs)以浓度和时间依赖的方式被人类神经干细胞吸收。暴露于高浓度石墨烯量子点的胚胎积累减少，可能是因为石墨烯量子点在E3溶液中的稳定性降低，聚集性增强，而E3溶液中含有无机离子(Na+、K+、Mg2+和Ca2+)，阻碍了石墨烯量子点穿透绒毛膜。在这种情况下，绒毛膜有能力抵御高浓度石墨烯的入侵。最近的一项研究通过数学建模提出，石墨烯微片是通过边缘尖角和角落的自发膜渗透进入细胞的。虽然在这项研究中没有观察到氧化石墨烯直接自发的膜穿透，但如图3(B1)所示，氧化石墨烯穿透绒毛膜进入胚胎的模式是可能的。