斑马鱼胚胎对氧化石墨烯的吸收和线粒体损伤

图3、斑马鱼胚胎对氧化石墨烯的吸收和定位。(A)通过共聚焦显微镜实时监测氧化石墨烯-F在活体胚胎(24hpf)中的运输情况。将胚胎放入含有或不含氧化石墨烯-F的E3溶液中培养。经过8分钟的暴露期后，氧化石墨烯-F进入胚胎。红色箭头表示氧化石墨烯-F，蓝色箭头表示胚胎的详细视图。(B)10hpf时绒毛和胚胎对氧化石墨烯的吸收。红色、绿色和黄色箭头分别表示氧化石墨烯、线粒体和囊泡。氧化石墨烯附着并穿透胚胎绒毛膜(B1)。氧化石墨烯进入胚胎(B3)。B4是B3中黄色矩形的详细视图。Ch：绒毛膜；Ou：绒毛膜外部；In：绒毛膜内部；Po：绒毛膜孔道；Mi：线粒体；Ve：囊泡。

为了检查氧化石墨烯向胚胎的运输情况，用氧化石墨烯-F培养24hpf以上的斑马鱼胚胎，然后通过LSCM直接观察。在氧化石墨烯-F培养期开始时，胚胎中未观察到荧光(图3A)。8分钟后，胚胎周围出现荧光，尤其是卵黄囊附近(图3A)，这表明氧化石墨烯进入胚胎并选择性地定位于卵黄囊。TEM还显示，氧化石墨烯吸附在绒毛膜表面，渗透绒毛膜(图3B)，并定位在卵黄囊周围。在用氧化石墨烯处理的胚胎中观察到许多含有氧化石墨烯聚集体的囊泡，而对照组中没有这些囊泡(图3B2-4)。此外，胚胎对氧化石墨烯的吸收并没有随着氧化石墨烯浓度的增加而增加，与使用1毫克/升氧化石墨烯处理的胚胎相比，使用10毫克/升或100毫克/升氧化石墨烯处理的胚胎对氧化石墨烯的吸收减少了。

图3、(C)96hpf后斑马鱼胚胎中氧化石墨烯的定位。(D)胚胎中氧化石墨烯的半定量分析是通过ImageJ软件根据氧化石墨烯聚集面积与整个图像面积之比进行的。(E)和(F)36hpf时氧化石墨烯对胚胎线粒体的损伤。(G)胚胎中氧化石墨烯聚集体的拉曼光谱。氧化石墨烯-F：用异硫氰酸荧光素标记的氧化石墨烯；TEM：透射电子显微镜。

制备石蜡切片以检测96hpf时斑马鱼胚胎中氧化石墨烯的定位情况，结果发现氧化石墨烯主要聚集在眼睛、心脏、卵黄囊和尾部周围。此外，在96hpf时将胚胎横切成三段，并进行TEM观察以确认氧化石墨烯在胚胎这些区域的定位(图3C)。结果发现，与头部或尾部相比，胸部聚集了更多的氧化石墨烯(图3D)。此外，线粒体有规律地分布在整个胚胎细胞中，对照组的线粒体结构紧凑，膜完整(图3E)。然而，当胚胎暴露于1mg/L氧化石墨烯中8小时后，线粒体膜变得肿胀和松散，其完整性受到破坏(图3F)，这表明氧化石墨烯的吸收和定位可能会导致斑马鱼胚胎线粒体受损。拉曼光谱(RS)中典型的D和G波段分别在约1355和1602cm-1处，它们反映了氧化石墨烯的无序结构和有序sp2碳结构。在本研究中，用氧化石墨烯处理过的胚胎中检测到了D和G波段(图3G)，这证实了上述聚集体中含有氧化石墨烯。

氧化石墨烯对死亡率、孵化、心跳、运动和形态的影响

图4、氧化石墨烯对斑马鱼胚胎发育过程中的孵化、心跳、运动和畸形的影响。(A)在72和96hpf暴露于氧化石墨烯的斑马鱼胚胎的孵化延迟。(B)氧化石墨烯对48hpf胚胎心率的影响。使用体视显微镜直接监测胚胎的心率。(C)氧化石墨烯对48hpf胚胎自发运动的影响。(D)氧化石墨烯对96hpf胚胎畸形发生率的影响。在96hpf时测定典型胚胎畸形的发生率，包括心包/卵黄囊水肿、尾部/脊髓弯曲和无眼/无头。

与未经氧化石墨烯处理的对照组相比，经氧化石墨烯处理的任何一组胚胎的死亡率都没有明显增加。暴露于0.01-10毫克/升氧化石墨烯的胚胎的孵化率也得到了类似的结果(图4A)。然而，与对照组相比，用100毫克/升氧化石墨烯处理的胚胎发现了严重的孵化延迟：这些胚胎中只有不到30%在96hpf后孵化(图4A)。除了在48hpf暴露于100mg/L氧化石墨烯的胚胎外，大多数暴露于氧化石墨烯的胚胎的心率都有所降低。与对照组相比，经1毫克/升氧化石墨烯处理的胚胎的心率明显下降；但经100毫克/升氧化石墨烯处理的胚胎的心率则有所上升(图4B)。此外，与对照组相比，用100mg/L氧化石墨烯处理的胚胎在48hpf时的自发运动明显受到抑制(图4C)。有趣的是，胚胎附近绒毛膜中的氧气浓度与胚胎48hpf时的自发运动显著正相关(R2=0.84)。

氧化石墨烯会导致96hpf胚胎出现多种发育畸形，包括心包/卵黄囊水肿、尾部弯曲和眼睛/头部畸形。畸形的类型随着氧化石墨烯浓度的增加而变化(图4D)。在1毫克/升氧化石墨烯培养液中培养的胚胎表现出尾部弯曲，暴露于100毫克/升氧化石墨烯后出现眼部/头部畸形。然而，心包/卵黄囊水肿是主要的畸形，且发生率随着氧化石墨烯浓度的增加而增加。此外，去除绒毛后，与对照组相比，1毫克/升氧化石墨烯不会改变心率，但会显著增加心包水肿和尾部弯曲的发生率(p<0.05)。

畸形器官的细胞凋亡和氧化应激

图5、氧化石墨烯对96hpf后胚胎凋亡的影响。(A)胚胎特定区域凋亡的代表性图像。箭头表示胚胎的主要凋亡区域。(B)96hpf胚胎全身和特定区域凋亡的半定量分析。相对荧光强度通过减去胚胎的自身荧光进行调整。所有图像中的比例尺均为20毫米。

图6、胚胎中氧化石墨烯诱导的ROS。(A)96hpf时胚胎特定区域ROS生成的代表性图像。箭头表示胚胎中产生过量ROS的器官。所有图像的比例尺均为20毫米。(B)96hpf时胚胎全身和特定区域ROS的半定量分析。相对荧光强度通过减去胚胎的自身荧光进行调整。

在96hpf时，暴露于氧化石墨烯的胚胎的眼睛、心脏和尾部区域的细胞凋亡明显增加。此外，与对照组相比，胚胎全身和上述器官中与凋亡水平相对应的相对荧光强度显著增加(图5B)。胚胎全身产生的ROS呈浓度依赖性增加(图6B)。此外，在96hpf时，用1mg/L氧化石墨烯处理的胚胎的眼睛、心脏和尾部区域的ROS水平也明显增加(图6B)。此外，与对照组相比，氧化石墨烯以浓度依赖的方式下调了SOD活性，并显著增加了MDA的浓度(p<0.05)。说明氧化石墨烯诱导产生过多的活性氧，增加氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡。

遗传毒性

胚胎中8-OHdG的产生量随着氧化石墨烯浓度的增加而增加，与对照组相比，1毫克/升和100毫克/升的氧化石墨烯都显著增加了8-OHdG的水平(p<0.05)。然而，氧化石墨烯对全局DNA甲基化水平的影响是复杂的。1毫克/升的氧化石墨烯抑制了全局DNA甲基化水平，而100毫克/升的氧化石墨烯则促进了甲基化。