追踪氧化石墨烯的异位

氧化石墨烯(10mL，100mg/mL)和异硫氰酸荧光素(FITC)(100mL，1mg/mL)在超声下混合10分钟。用透析膜过滤FITC标记的氧化石墨烯(氧化石墨烯-F)溶液，去除游离的FITC。最后，通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对受精后24小时(hpf)胚胎中的氧化石墨烯-F运输进行实时监测。

有关分析方法的详细信息见补充材料。为了确认氧化石墨烯在胚胎中的转移和分布，我们制作了石蜡切片和超薄切片，并分别使用光学显微镜和透射电子显微镜(TEM)进行了显微结构和超微结构观察。有关分析方法的详细信息见补充材料。为了确定胚胎中的氧化石墨烯沉积物，使用514nm激光(DXR显微镜)记录了拉曼光谱。

死亡率、孵化、心率、自发运动和畸形

每天对胚胎进行分析，记录存活率、形态和毒性终点的变化。每24小时更换一次E3溶液(200mL)，直至96hpf。通过光学显微镜检查胚胎或幼鱼的运动、心跳和血液循环，确定其死亡率，并每天记录结果。在48hpf，记录胚胎的心跳和自发运动。72和96hpf时，分别记录胚胎孵化和是否出现身体异常。每个实验均一式三份。分析方法详见补充材料。

细胞凋亡、ROS和氧化应激的测量

根据Cheng等人之前描述的方法，对发育超过96hpf的斑马鱼胚胎的凋亡率进行了量化。

使用荧光显微镜观察荧光。分析方法详见补充材料。

根据上述实验，观察了暴露于1mg/L氧化石墨烯的胚胎，并注意到特定区域的胚胎凋亡和ROS生成。使用TU-1901分光光度计测量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，如前所述。

遗传毒性

使用DNeasy血液和组织试剂盒从发育超过96hpf的胚胎中分离出基因组DNA，具体操作方法请参阅生产商提供的说明书。斑马鱼体内8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)的浓度通过酶联免疫吸附法测定，具体方法见补充材料。使用2504.6-mmHypercloneC18色谱柱，通过高效液相色谱法(HPLC)测定DNA甲基化。全局DNA甲基化的百分比根据Ramsahoye方法进行量化。

统计分析

为了量化胚胎中的氧化石墨烯，使用ImageJ软件对TEM图像中观察到的氧化石墨烯聚集进行量化。相对荧光强度使用奥林巴斯FV-10ASW3.1软件进行量化。所有统计分析均使用IBMSPSS22.0统计软件。除非另有说明，每个实验至少一式三份。使用Levene中位数检验对数据进行同方差分析，并采用单因素方差分析来确定与暴露条件和处理相关的效应。邓尼特检验用于成对多重比较。所有分析的显著性水平均为p<0.05。

结果

氧化石墨烯特性

图1、氧化石墨烯的特征。(A)溶解在超纯水和E3溶液中的氧化石墨烯的Zeta电位。数据点对应的是平均值(两个重复；每个重复测量6次)。(B和C)显示氧化石墨烯厚度和直径的原子力显微镜图像；(C)箭头表示氧化石墨烯表面的缺陷。(D)TEM图像。(E)SEM图像。(F)使用ZETAPALS/BI-200SM仪器测量的氧化石墨烯大小。(G)氧化石墨烯的傅立叶变换红外光谱。AFM：原子力显微镜；TEM：透射电子显微镜；SEM：扫描电子显微镜；FT-IR：傅立叶变换红外光谱。

本研究详细考察了E3溶液中氧化石墨烯的特性。我们在230纳米波长处检测到一个峰值，在大约280纳米波长至300纳米波长处检测到一个峰肩，这与氧化石墨烯的典型紫外吸收光谱相符。然而，在超纯水中，氧化石墨烯的zeta电位为-30.5mV，而在E3溶液中则升至-20.1mV(图1A)。TEM和SEM图像显示了氧化石墨烯纳米片的不规则褶皱，这反映了氧化石墨烯的柔韧性(图1D和E)。原子力显微镜成像显示，氧化石墨烯纳米片的厚度约为0.8-1纳米(图1B和C)，直径约为101-258纳米(以147纳米为中心)，这是通过广角光散射测量的(图1F)。氧化石墨烯的傅立叶变换红外光谱清楚地显示了-OH(~3340cm-1)、C=O(~1720cm-1)、C=C(~1620cm-1)、C-OH(~1400cm-1)和C-O-C(~1070cm-1)官能团的存在(图1G)。上述结果验证了所使用的纳米材料是典型的氧化石墨烯。此外，EDX图像按原子百分比记录了86.44%的C、12.74%的O、0.02%的S、0.01%的K和0.79%的Cu(主要由铜网格贡献)。

氧化石墨烯最初包裹绒毛膜，诱发缺氧微环境

图2(A)中的光学显微镜图像显示，未接触氧化石墨烯的对照组斑马鱼胚胎是透明的。然而，在暴露于氧化石墨烯的胚胎中，绒毛膜外出现了黄色的氧化石墨烯沉积物，这表明氧化石墨烯吸附在绒毛膜上。这一现象在幼鱼的光学图像上得到了证实，在胚胎暴露于氧化石墨烯后，幼鱼的光学图像上显示出许多深黄色的薄片(氧化石墨烯)附着物。扫描电镜显示，胚胎绒毛膜外层覆盖着大小不一的突起物。此外，扫描电子显微镜证实氧化石墨烯覆盖了绒毛膜(图2B)。绒毛膜被氧化石墨烯包覆会改变绒毛膜的官能团，例如胚胎暴露于1mg/L氧化石墨烯后，绒毛膜中的C-OH(1400cm-1)增加，C=O(~1700cm-1)减少。

图2、绒毛膜被氧化石墨烯包覆会导致胚胎缺氧。24hpf后斑马鱼胚胎的光学显微镜(A)和扫描电镜(B)图像。绒毛膜250微米深处的氧气浓度(A中的红色标签)。红色箭头表示SEM图像中绒毛表面的氧化石墨烯聚集体。(C)48hpf时，使用氧气微电极检测绒毛0至250毫米深处的氧气浓度。黑色矩形表示绒毛膜中的氧浓度与对照组相比有显著差异。

在对照样本中，绒毛膜附近的氧气浓度为271毫摩尔，当微电极插入胚胎250毫米深处时，绒毛膜空间的氧气浓度逐渐下降到264毫摩尔(图2C)。对于暴露于1、10和100毫克/升氧化石墨烯的胚胎，在250毫米的深度，氧气浓度分别变为244、243和227毫摩尔，与对照组相比显著下降(p<0.05)(图2C)。此外，用氧化石墨烯处理的脱绒毛胚胎与对照组的氧气浓度没有明显差异。这些数据表明，氧化石墨烯的包被会导致胚胎缺氧。