摘要

氧化石墨烯在生物、医疗、能源和电子应用方面显示出巨大的潜力。由于这些应用的多样性，氧化石墨烯不可避免地会释放到生态系统中；然而，相应的风险在很大程度上是未知的，尤其是在胚胎发育的关键时期。本研究发现，氧化石墨烯主要通过羟基相互作用附着并包裹在斑马鱼胚胎的绒毛膜上，堵塞了绒毛膜的孔道，造成明显的缺氧和孵化延迟。此外，氧化石墨烯会自发穿透绒毛膜，通过内吞作用进入胚胎，破坏线粒体，并主要转位到斑马鱼的眼睛、心脏和卵黄囊区域，这些区域涉及斑马鱼的循环系统。在这些器官中，氧化石墨烯诱导产生过多的活性氧，增加氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡。氧化石墨烯还会诱发眼睛发育畸形、心脏/卵黄囊水肿、尾部弯曲和心率下降。与纳米粒子常见的剂量效应关系不同，随着氧化亚石墨烯浓度的增加，其对心率和尾部/脊髓弯曲的不良影响先增加后减小。这些发现强调了氧化石墨烯对胚胎发育的特定不利影响，并突出了氧化石墨烯的潜在生态和健康风险。

引言

基于二维氧化石墨烯的材料因其独特的物理化学特性，已引起各研究界和工业界的广泛关注。有报告预测，到2020年，基于氧化石墨烯的产品市场规模将达到6.75亿美元。遗憾的是，虽然基于氧化石墨烯的材料使用量的增加促进了它们在环境中的释放，但与环境接触氧化石墨烯有关的健康风险在很大程度上还不为人所知，特别是在胚胎发育方面。有关氧化石墨烯纳米毒性的少量研究是在哺乳动物、生物大分子、细菌和不同的细胞系中进行的。使用体外细胞培养来初步评估纳米材料的毒性相当简单，而且成本效益高；但是，要模仿体内系统几乎是不可能的，而且已经报道了一些有争议的结果。尽管小型哺乳动物模型仍然是评估纳米材料可能对人体产生的毒性和分布的标准方法，但建立哺乳动物模型往往成本高昂且耗时较长。因此，斑马鱼(Daniorerio)已被确立为研究纳米材料体内毒性的首选脊椎动物模型，这是因为斑马鱼和人类基因组之间存在密切的同源性。此外，斑马鱼和人类表现出相似的生理反应，尤其是在慢性疾病的发展过程中。

胚胎发育是生命的一个重要阶段，胚胎发育的功能障碍与各种疾病和不良影响有关，如缺氧、畸形、器官功能和蜕皮。斑马鱼胚胎是一种独特的模型系统，可用于研究纳米粒子对胚胎发生的影响；然而，迄今为止，有三个关键问题一直被忽视。首先，与其他纳米材料相比，氧化石墨烯具有优异的机械和亲水性能，同时保持高度的柔韧性和延展性。这些特性使氧化石墨烯能够附着在单个细胞表面。此外，最近的研究表明，氧化石墨烯可以包覆活的微生物；但是，氧化石墨烯对大型胚胎的包覆以及这一过程的不利影响仍不清楚。其次，与常见的纳米粒子相比，尽管氧化石墨烯纳米片的厚度只有大约1纳米，但它的尺寸却相当大，长度从几十纳米到几毫米不等。因此，氧化石墨烯渗透胚胎并转运到特定器官的实时动态可能是独一无二的。第三，与碳纳米管(CNT)和富勒烯相比，二维氧化石墨烯纳米片的结构决定了其在体内的命运和生物相容性。氧化石墨烯的特殊包覆和转运特性可能会诱发独特的纳米毒性，因此应对此进行深入探讨。

本研究的主要目的是描述氧化石墨烯纳米片与斑马鱼胚胎之间的相互作用，并分析氧化石墨烯在体内的定位和不利影响。具体来说，我们确定了以下特性：(i)氧化石墨烯包覆发育中胚胎的绒毛膜及其在此背景下的缺氧效应；(ii)氧化石墨烯向胚胎特定器官的转移；(iii)活性氧(ROS)的过度生成、细胞凋亡、DNA损伤和发育畸形之间的关系。

方法

氧化石墨烯特性

目前环境中的氧化石墨烯浓度尚不清楚。为了能够与毒性试验中报告的碳纳米材料剂量进行直接比较，在E3胚胎培养基(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4；pH7.4)中制备了不同浓度(100、10、1.0、0.1或0.01mg/L)的氧化石墨烯悬浮液。氧化石墨烯纳米片(纯度>99%，单层比~99%)来自南京新纳米材料科技有限公司。将100.0毫克的氧化石墨烯溶解在1000毫升的E3溶液中，然后超声1小时，就得到了100毫克/升的氧化石墨烯水溶液。使用Agilent 5420 AFM仪器在攻丝模式下采集原子力显微镜(AFM)图像。在恒定的pH值(pH7.4)下，使用配备30mW 635nm激光的ZETAPALS/BI-200SM仪器对粒度分布和Zeta电位进行表征。所有样品的紫外可见光谱都是在配有UVW5软件的T90分光光度计上，在200-800纳米的1厘米路径长度石英比色皿中记录的。傅立叶变换红外光谱(FT-IR)由布鲁克Tensor27红外光谱仪记录，分辨率为2cm-1，波长为4000-400cm-1。为了检测组成氧化石墨烯的元素，还进行了能量色散光谱分析。

斑马鱼和胚胎暴露于氧化石墨烯的情况在补充材料中有所描述。

氧化石墨烯暴露下的胚胎和缺氧微环境

为了研究氧化石墨烯对胚胎的包裹作用，使用日立SU8010显微镜进行了扫描电子显微镜(SEM)观察。更多详情见补充材料。为了研究氧化石墨烯对绒毛功能群的影响，绒毛被从胚胎中分离出来并用傅立叶变换红外光谱进行分析。为了测量胚胎的缺氧微环境，使用Unisense氧气微电极测量了氧气浓度。