3.结果与讨论

3.1.pH冲击对Val-A产量和菌体生长的影响

经过初步筛选pH，pH冲击在8.0时效果最佳。分别向发酵液中添加三种常见的碱性溶液。发现两种有效的添加剂氢氧化钠和氨水，而磷酸盐缓冲液则产生相反的效果(图1a)。这与一些出版物一致，这些出版物记载过量的无机磷酸盐通常会抑制次级代谢产物的生产(Sola et al.,2003)。因此，所得结果表明pH冲击有利于Val-A的生产。氢氧化钠组的Val-A产量最高，因此选择氢氧化钠进行进一步研究。关于pH冲击的适宜时间，选择4 h-24 h内的5个时间点作为最旺盛的时期(图1b)。当碱性冲击时间晚于24小时时，该处理对Val-A产量没有显著影响，未在图1b中显示。很明显，第20小时是进行pH冲击的最佳时间。在4 h-12 h添加氢氧化钠时，细胞仍处于生长早期，碱性溶液的刺激在一定程度上阻碍了细胞的生长，因此pH冲击没有明显效果甚至降低了Val-A的产量。至于不同的处理次数，发现多次pH冲击的效果未达到预期(图1c)。在Val-A合成过程中，发酵液的pH会持续上升，这使得多次pH冲击的效果不如单次pH冲击显著。总之，最佳条件是在第20小时向发酵液中添加氢氧化钠溶液，而过多的无机磷酸盐对Val-A生产有阻碍作用。pH冲击对吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008的细胞重量有显著影响，在96小时时从6.00 g/L增加到6.60 g/L(图2)。

发酵24小时后，pH冲击组的细胞积累量更高，pH冲击组的细胞生长速率比对照组快。这一现象表明pH刺激了链霉菌的代谢，在一定程度上加速了其生长，同时伴随着Val-A的大量合成，增加了27.43%。在第四天，pH冲击组的Val-A产量和产率(13.29 g/L;2.01 g/g蛋白)均高于对照组(10.78 g/L;1.80 g/g蛋白)(图1c和图2)。可以推测，在发酵早期积累了前体，然后这些前体被用来合成Val-A。Val-A产量的增加是生物量和产量增加的综合效应。糖的消耗反映了链霉菌的能量代谢。Val-A合成的碳源前体是磷酸戊糖途径上的景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose 7-phosphate)(Degwert et al.,1987;Toyokuni et al.,1987)。pH冲击组在第一天的糖消耗速率[2.23 g/(L·h)]快于对照组[1.91 g/(L·h)]，且pH冲击组的细胞代谢活性相对较高(图2)。这主要是由于碱性刺激，细胞加速利用碳水化合物产酸以恢复pH。此外，发酵液中糖的消耗为细胞生长提供了能量，这与生物量的增加相符。

3.2.S.Hygroscopicus 5008培养过程中的pH变化

在5008正常情况下，发酵液pH逐渐升高。在发酵前期，pH缓慢上升，然后快速上升直至达到峰值并趋于稳定(图3)。发酵液pH是微生物发酵的综合结果。Val-A可以与氢离子结合，导致发酵液中羟基离子比例上升(Bai et al.,2006)。因此，在发酵后期，当Val-A大量合成时pH上升。在pH冲击组中，菌丝体首先在自然条件下培养20小时，然后在pH 8.0进行碱性pH冲击。之后，pH在短时间内迅速下降，这是由胁迫响应引起的。最终，pH在60小时后恢复，进行后续发酵。此外，Val-A在酸性条件下(pH<5.0)可被水解(Jin et al.,2006)，因此发酵pH的升高也有利于Val-A的积累和稳定。

胞内pH对微生物的生长和代谢至关重要，它可以影响营养吸收和利用、蛋白质合成、线粒体呼吸、碳水化合物代谢和其他重要的生命活动(Cotter et al.,2001)。因此，只有保持胞内pH的稳定，才能确保微生物的正常生长和代谢。如图3所示，在整个发酵过程中，胞内pH略有上升，从初始的7.21到最终的7.73。Corvini(Corvini et al.,2004)也使用BCECF-AM荧光探针测定普拉链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)的胞内pH，范围在6.5到8.5之间。还发现基因SHJG7463编码的阳离子转运ATP酶在DNA微阵列中高表达，表明阳离子转运加速以中和pH的变化。此外，大量的ATP将被消耗以转运细胞膜内外的氢离子，这也解释了下面关于菌丝体呼吸活性的现象。此外，需要注意的是，三羧酸循环导致外部pH上升，而糖酵解和谷氨酸的合成通常导致酸化。因此，pH冲击组中的pH波动可能是碳水化合物快速消耗和氨基酸代谢的综合结果。

3.3.pH冲击诱导的基因表达全局变化

使用统计标准Fold change大于2且p小于0.05，在菌株5008中鉴定出总共146个pH冲击下的差异表达基因(DEGs)(表1)。在pH冲击下显著变化的DEGs主要分配了代谢、细胞过程和信号传导以及信息存储和处理相关的功能。正如预期的那样，大多数Val-A生物合成基因的转录水平在pH冲击下得到增强，除了葡糖基转移酶基因valG。

在与代谢相关的DEGs中，基因SHJG7463编码细胞膜上的阳离子转运ATP酶。这些基因的上调表达表明链霉菌细胞中的转运蛋白可以及时响应pH冲击，这有利于营养吸收和次级代谢产物的排泄，并且相关的阳离子转运蛋白基因与链霉菌发酵过程中的pH变化和呼吸链密切相关。编码谷氨酰胺合成酶的SHJG3702上调。这与Gu的研究(Gu et al.,1984;Wei et al.,2012)一致，该研究表明谷氨酰胺和3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-Amino-5-hydroxy benzoic acid)可显著提高Val-A产量，并且谷氨酰胺合成酶活性与Val-A产量呈正相关。另一个DEG SHJG6704编码铵透性酶(ammonium permease)。夏(Xia and Jiao,1986)发现添加铵离子可以通过加速氮代谢促进Val-A合成过程中的细胞生长。SHJG6704的上调表达为Val-A提供了更多的氮源，并促进了细胞生长。SHJG0557编码一种细胞色素bd型醌氧化酶(cytochrome bd-type quinol oxidase)。SHJG7814编码一种粪卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen III oxidase)和相关的Fe-S氧化还原酶。铁硫氧化还原酶、细胞色素和铁硫蛋白是细胞电子呼吸链的组成部分。SHJG0557和SHJG7814的上调表达意味着吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008的呼吸发生了变化，这是pH冲击的响应措施之一。

在与细胞过程和信号转导相关的DEGs中，编码UDP-N-乙酰胞壁酸脱氢酶(UDP-N-acetylmuramate dehydrogenase)的基因SHJG3272上调了2.99倍，而编码细胞分裂蛋白FtsI/青霉素结合蛋白2(cell division protein FtsI/penicillin-binding protein 2)的基因SHJG3894和SHJG3896以及几个细胞壁水解酶基因则下调。这些基因与细胞壁合成相关，表明在pH冲击的影响下，细胞壁合成过程得到加强。

在与信息存储和处理相关的DEGs中，大部分是转录调控因子，它们在次级代谢产物合成的调控中发挥作用，也表明S.hygroscopicus 5008通过复杂的信号转导系统响应pH冲击。原核生物的基因转录需要由核心酶和σ因子组成的RNA聚合酶。编码RNA聚合酶ECF亚家族σ因子的基因SHJG6022显著上调。在天蓝色链霉菌中，双组分调控系统Cse B/Cse C影响σE(sigma E)的活性(Paget et al.,2002)。环境胁迫信号由双组分系统传导。该系统与σE的启动子结合，然后在核心酶的相互作用下激活转录。因此，推测双组分系统和σE的相互作用也可能在S.hygroscopicus 5008中参与，可以传递pH胁迫信号并调控参与Val-A生物合成的基因的表达。

总之，这些DEGs主要与氨基酸代谢、细胞过程和信号传导以及信息存储和处理相关。此外，通过qRT-PCR分析验证了关键基因的动态变化。在转录变化方面，DNA微阵列和qRT-PCR分析之间显示出良好的一致性，表明了微阵列数据的可靠性。可以推测，在外源pH冲击下，细胞壁接收的胁迫信号通过双组分系统进行转导。然后由双组分系统调控的ECFσ因子将与核心酶一起作用于下游基因并激活细胞防御系统。最终，营养物和离子转运加速，导致葡萄糖代谢、氨基酸代谢、呼吸链和其他生理活动的变化，同时也缓解了碱性刺激并促进了Val-A的生物合成。

表1 pH冲击后5008中的差异表达基因：使用COG进行分类

3.4.Val-A发酵过程中呼吸活性的变化

如图4所示，两种策略下的菌丝体呼吸活性在接种后均下降，这可能归因于程序性细胞死亡。36小时后，由于蛋白质的快速合成和更多的细胞积累，pH冲击组的呼吸活性持续增加了12小时，然后开始下降。微生物呼吸链成分的基础是NAD、FAD、FAM、铁硫蛋白(Fe-S)、泛醌(辅酶Q)和细胞色素系统。上调表达的基因SHJG0557编码细胞色素BD氧化酶，SHJG7814编码铁硫氧化还原酶，这些酶是呼吸链的基本组成部分。可以推测，pH冲击后呼吸电子传递链中的酶活性增强，因此电子传递和呼吸加速以产生更多能量，这对于Val-A合成至关重要。

3.5.pH冲击对氮代谢的影响

先前的研究使用氮同位素标记法报道，谷氨酸很可能是氮桥的主要来源(Mahmud et al.,1999)。根据Hodgson的报告(Hodgson,2000)和KEGG，S.hygroscopicus 5008的氮同化途径如图5所示。当氮源充足时，铵被谷氨酸脱氢酶催化成谷氨酸。当缺乏氮源时，铵主要被谷氨酰胺合成酶(GS)催化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺转化为谷氨酸。谷氨酰胺和谷氨酸都参与了Val-A生物合成的一系列反应过程。微阵列和qRT-PCR的结果显示，基因SHJG3702和SHJG6704均上调。随后，我们发现pH冲击组胞内谷氨酸浓度是对照组的2.82倍（图5），这表明在pH冲击下铵离子转运加速，从而产生更多的谷氨酰胺和谷氨酸。显然，细胞处于相对高氮的环境中，而Val-A合成正在进行，因此更多的氮前体（谷氨酸）有利于Val-A的合成。此外，先前对一系列微生物的研究表明，输入的肽可以被分解成游离氨基酸，形成重要的质子来源(Giotis et al.,2010)。谷氨酸是酸性氨基酸，增加的谷氨酸除了提供氮源外，还可以缓解碱的压力。

图5.pH冲击后5008的氮同化途径和胞内游离谷氨酸的变化。

4.结论

碱性pH冲击使Val-A产量显著提高了27.43%。结合DNA微阵列，研究了其对细胞呼吸活性和胞内微环境的影响，揭示了链霉菌对pH冲击的细胞响应机制（图6）。pH冲击加速了质子转运并增强了细胞的呼吸活性，从而为细胞生长提供了更多能量。并且此过程中酸性氨基酸的形成为井冈霉素合成提供了更多的氮前体。因此，上述因素的共同作用提高了Val-A的产量。显然，在链霉菌发酵中应更加重视碱性pH冲击。

致谢

本工作得到浙江省公益项目(2016C32007)、国家重点研发计划(2016YFD0401201)、浙江省科协青年人才培育项目(2016YCGC004)和国家自然科学基金(20906060)的资助。