2.材料与方法

2.1.微生物与发酵条件

所用菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008(CGMCC 4.1026)是一种工业上生产Val-A的菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

孢子琼脂培养基组成如下：豆粕20 g/L，麦芽糖20 g/L，琼脂20 g/L。用2 mol/L NaOH将培养基pH调至7.0，并在121°C高压灭菌20分钟。在37°C培养八天后收集孢子，悬浮于20%(v/v)甘油中，-80°C保存备用。

种子培养基组成如下：玉米粉30 g/L，豆粕22 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 0.8 g/L。接种50μL孢子悬液(1.5 x 10⁹cfu/mL)后，在37°C，220 rpm的旋转摇床上，在250mL摇瓶（含50 mL种子培养基）中进行预培养。

对于Val-A生产，发酵培养基组成如下：玉米粉100 g/L，豆粕25 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 1 g/L，KH2PO4 1.5 g/L。将5 mL种子培养物接种到含有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，在37°C，220 rpm下发酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。

2.2.Val-A生产的pH冲击策略

2.2.1.不同碱性溶液进行pH冲击

当发酵进行24小时时，分别通过添加2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水，将不同处理组的发酵液pH从自然pH 6.4调节至pH 8.0。

2.2.2.pH冲击的不同时间点

六个不同处理组的发酵分别持续4 h、8h、12h、16h、20h和24h，然后通过添加2 mol/L NaOH将发酵液pH调节至pH 8.0，进行后续培养。

2.2.3.不同处理次数

三组设置如下：

•单次pH冲击处理：当发酵进行20小时时，通过添加2 mol/L NaOH将发酵液pH调节至pH 8.0。

•两次pH冲击处理：当发酵进行20小时和44小时时，用2 mol/L NaOH将发酵液pH调节至pH 8.0。

•三次pH冲击处理：当发酵进行20小时、44小时和68小时时，用2 mol/L NaOH将发酵液pH调节至pH 8.0。

2.3.细胞重量、残留碳源和Val-A产量的分析

每天取2mL发酵液样品用于分析细胞重量、残留碳源和Val-A产量。样品在12,000g下离心5分钟。取0.5mL上清液，用等体积的氯仿萃取，然后用0.22-μm亲水性滤膜过滤。含有Val-A的过滤样品采用高效液相色谱法(HPLC)进行分析(Iwasa et al.,1971)。由于种子培养基中的玉米粉和豆粉不溶，标准的干重法不可行，因此使用标准的Bradford法测量细胞内蛋白质以反映细胞生长(Kieser et al.,2000)。培养基中的总残留糖（作为碳源）采用标准的苯酚-硫酸法测定(Liao et al.,2009)。

2.4.胞外和胞内pH测量

胞外pH(pHex,培养基pH)使用pH微电极计(Unisense,Denmark)测量。

胞内pH(pHi)使用pH敏感染料2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯(2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester,BCECF-AM;Beyotime Institute of Biotechnology,江苏,中国)测量。本研究采用双激发比率法，借助多扫描光谱仪(SpectraMax M5,CA,USA)进行；激发波长分别为440nm和488nm，发射波长为535 nm。使用离子载体尼日利亚菌素(nigericin;Sigma,Lezennes,France)和一组pH范围从6.5到8.5的确定的高K⁺磷酸盐缓冲液进行体内校准(Corvini et al.,2000)。

2.5.DNA微阵列实验和微阵列数据分析

使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Hidden,Germany)按照制造商的说明分离和纯化总RNA，并使用Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent,CA,USA)检查质量和数量。使用Low Input Quick Amp Labeling Kit,One-Color对总RNA进行扩增和标记。使用RNeasy Mini Kit纯化Cy3标记的cRNA。在Hybridization Oven中杂交17小时。杂交后，在Gene Expression Wash Buffer Kit中清洗载玻片，并使用Agilent Microarray Scanner G2565CA扫描微阵列。

使用Feature Extraction Software 10.7进行阵列图像的采集和量化，并使用Quantile算法对原始数据进行归一化处理。计算每个基因的归一化表达比率，并使用标准fold change

>2.0且p<.05进行显著性检验。采用统计学分析（t检验）中p值最低的变化值作为最可靠的值。为了用一个技术重复代表每种培养条件下三次测量的变异，计算了变异系数(CV)。在样本中，至少98%的基因组产生了可检测的转录本，平均变异系数不超过0.15，符合Agilent的质量控制建议。

2.6.通过定量实时RT-PCR验证微阵列数据

使用Trizol(Invitrogen,CA,USA)提取总RNA，并用gDNA Eraser(Takara,大连,中国)处理。随后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara,大连,中国)进行反转录。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Ti RNaseH Plus)(Takara,大连,中国)在StepOne Real-Time PCR(Applied Biosystems)上测定基因的转录水平。PCR条件为：95°C预变性10分钟，然后进行40个循环：95°C变性15秒，58°C退火60秒，72°C延伸15秒。对于每个基因，将种子阶段的发酵样品定义为表达水平1.0，结果表示为mRNA水平相对于对照样品的倍数增加(Feng et al.,2016)。

2.7.胞内游离谷氨酸浓度的测定

使用HPLC采用茚三酮比色法测定在37°C(220 rpm)下培养两天的菌株5008的胞内游离谷氨酸。从发酵培养基中不同时间点抽取的生物量样品在12,000g下离心5分钟，洗涤两次，重新悬浮在1 mL ddH2O中，并在冰浴中通过超声破碎（20个循环，每个循环5秒超声，间隔10秒）。通过9000g离心10分钟去除细胞碎片，然后将上清液与10%的水杨基磺酸(salicylsulfonic acid)混合，在-20°C下放置20分钟，然后在12,000g下离心60分钟分离。然后，将提取物蒸发，用1 mL 0.02 mol/L HCl重新悬浮，并用0.22μm水相滤膜过滤(Wu et al.,2012)。将20μL每个样品注入HPLC进行谷氨酸测量。

2.8.CTC染色

5-氰基-2,3-二苯基氯化四氮唑(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride,CTC)是一种可溶、不发荧光的染色剂。它可被呼吸细胞的电子传递链吸附并还原成不溶的红色荧光物质(CTC formazan)，并在细胞中积累。因此，这种氧化还原染料已被广泛用于确定细菌的呼吸活性。荧光强度越高代表呼吸活性越高。通过12,000g离心5分钟从摇瓶中收集菌丝体，洗涤两次并重悬于生理盐水(0.9%NaCl)中。使用Bacstain-CTC快速染色试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)在1.5 mL离心管中按照说明书进行CTC染色30分钟(37°C)(Winding et al.,1994)。将200μL染色样品置于96孔板中，使用Multiscan Spectrum(SpectraMax M5,CA,USA)在488 nm激发波长和620 nm至640 nm发射波长下进行测量。