摘要

井冈霉素A(Val-A)是由链霉菌产生的次级代谢产物，在农业上广泛应用于防治水稻纹枯病、稻曲病和猝倒病。本研究探讨了碱性pH冲击对提高Val-A产量的影响及其机制。通过使用氢氧化钠进行一次或多次冲击处理，获得了更高的Val-A产量，同时伴随更快的蛋白质合成和糖消耗，碱性pH冲击可使Val-A产量提高27.43%。与氨基酸代谢、碳代谢和电子呼吸链相关的基因转录显著上调，同时呼吸活性和谷氨酸浓度大幅增加。Val-A产量的提高是通过一系列复杂机制实现的，并响应了pH胁迫信号，这导致了谷氨酸代谢和呼吸活性的增强。所获得的信息将有助于未来提高抗生素产量的研究以及分子机制的深入揭示。

1.引言

井冈霉素A(Val-A)是由工业菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008发酵产生的抗真菌抗生素，已在东亚地区广泛用作防治水稻纹枯病、稻曲病和猝倒病的首要药剂。提高Val-A产量已引起广泛关注，但似乎对提高生产率收效甚微。pH是微生物代谢的综合反映，因此影响发酵过程和细胞生长。pH可影响代谢方向，并且不同阶段生长和产物合成的最适pH也不同。相同的微生物在不同的环境pH条件下可能产生不同的代谢产物。例如，黑曲霉(Aspergillus niger)在pH 2-3下发酵蔗糖主要产生柠檬酸，但当pH变为7时，主要产生草酸(Lu et al.,2016)。因此，在发酵过程中，采用适当的策略控制pH可以获得所需产物。

发酵pH对链霉菌发酵也有很大影响，其中一些菌株具有特定的响应措施。不同抗生素的合成需要不同的pH，即使是同一种抗生素，在不同培养阶段也需要不同的pH才能获得最高产量。根据Chan的研究(Chan et al.,2015)，提出了一种两阶段pH控制策略，即在培养112小时后将培养pH从5.5转变为5.8，以提高恩拉霉素(enduracidin)的产量，生产率提高了51.2%。再比如，通过基于原位pH监测的种子阶段开发，ε-聚-L-赖氨酸(ε-poly-L-lysine)的产量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。

环境胁迫一直是提高链霉菌次级代谢产物的关键途径，环境信号可以通过启动复杂的转导系统来提高次级代谢产物的产量(Li et al.,2016)。链霉菌根据不同类型的环境因素，拥有许多独特的信号转导机制。在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中，pH冲击诱导了放线紫红素(actinorhodin)的调控基因和生物合成基因的过表达(Kim et al.,2007,2008)。此外，在链霉菌(Streptomyces sp.)CK4412中，推定的酸冲击诱导基因SCO7832的表达通过途径特异性调控基因的过表达刺激了tautomycetin的产量(Park et al.,2009)。此外，双组分调控系统(two-component regulatory system)也是一种非常重要的调控方式。据报道，双组分系统DraR/DraK参与了天蓝色链霉菌中抗生素生物合成的调控(Yeo et al.,2013)。在白色链霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18中，研究了其对酸性pH以实现高产ε-聚-L-赖氨酸的生理响应，与转录调控、胁迫响应蛋白、转运蛋白、细胞壁和细胞膜、次级代谢产物生产、DNA和RNA代谢以及核糖体亚基相关的基因在酸性pH响应中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而，关于pH冲击对Val-A产量及生物合成途径基因表达影响的信息很少，而这些信息对于改进抗生素发酵和降低成本具有重要价值。直到最近，我们首次采用碱性pH冲击来增强Val-A产量，并初步确定用于pH冲击的适宜pH约为8.0(Zhou et al.,2016)。

本工作旨在研究pH冲击对Val-A发酵过程的影响，并揭示pH与Val-A产量之间的关系。基于吸水链霉菌S.hygroscopicus 5008在不同pH冲击条件下合成Val-A的产量变化规律以及最新的基因组研究进展，研究了pH对基因表达的影响及其在生理水平上的规律，以探索pH冲击提高Val-A产量的机制。首先，选择pH作为环境胁迫来提高Val-A产量，进行了代谢活性分析，并构建了包含pH冲击的高效发酵策略。此外，依次探讨了pH冲击对基因表达和细胞微环境的影响。最后，全面讨论了pH冲击对Val-A产量的作用机制。据我们所知，这是在Val-A发酵上采用环境胁迫的首次尝试。它也可为其他放线菌生产抗生素提供良好的参考。