结果：

1.溶液中的H2浓度

图1 H2溶解生理盐水的制备和H2浓度的测量A：将生理盐水袋放入丙烯酸真空室，其中的空气被100%的H2气体取代；B：30分钟内生理盐水袋中和输液管出口处的H2浓度。全线表示盐水袋中的H2浓度，断线表示输液管出口处的H2浓度。

在丙烯酸真空室中暴露于100%的H2气体24小时后（图1A），生理盐水袋中的H2溶解浓度为87.2%。换句话说，H2气体很容易穿透塑料袋，溶液在24小时内几乎与环境中的H2气体达到平衡。然而，从试验室取出后，袋中的H2浓度在30分钟内降至61.2%（图1B）。在持续灌流（10毫升/分钟）的情况下，输液管出口处的H2浓度最初为53.8%，但在30分钟内降至47.2%（图1B）。

2.H2对组织损伤的影响

图2：A：通过HE染色的角膜切片研究H2治疗的组织学影响；B：第7天H2组和生理盐水组眼球前节摄影的比较。

HE染色显示第1天角膜缘有各种炎症细胞。虽然这些细胞在第7天明显浸润了生理盐水组的角膜中心，但这种变化在H2组明显很小（图2A）。同样，前段摄影显示，生理盐水组在第7天出现严重的红斑和角膜翳，而H2组的变化极小（图2B）。

3.H2对角膜新生血管的影响

图3评估角膜新生血管对H2治疗的反应A：免疫组化评估第7天角膜中心JG12阳性的血管内皮细胞（箭头）；B：H2治疗显著减少了角膜中心的毛细血管管腔。

血管内皮细胞特异性JG12染色用于评估新生血管（图3A）。具体来说，通过计数显微镜视野中标记的毛细血管腔来评估新生血管的程度。与生理盐水组相比，H2组的新生血管在第7天被抑制了约60%（图3B）。

4.H2对炎症细胞的影响

图4 H2处理对自由基和中性粒细胞浸润的影响A：各时间点用生理盐水或H2处理的EST染色（箭头）损伤角膜的代表性图像。同时还显示了免疫染色序列切片分析中EST阳性细胞和8-OH-dG阳性细胞的关联比较。B：外周角膜中EST阳性细胞数量的柱状图；H2组和生理盐水组之间存在明显的统计学差异。C：使用低真空扫描电子显微镜和PAM染色，比较两组的胶原纤维和浸润细胞。

图4A显示了6小时后角膜缘和第1天角膜中央的EST阳性中性粒细胞，以及第1天角膜中央的8-OHdG阳性细胞。在这里，EST阳性的中性粒细胞直接浸润了8-OHdG阳性角膜近端的区域基质细胞，表明自由基的参与。与生理盐水组相比，H2组在这两个时间点观察到的中性粒细胞数量明显较少（图4B）。此外，LV-SEM显示，与生理盐水组相比，H2组基质胶原纤维的结构发生了变化，纤维内的炎性细胞数量也减少了（图4C）。

图5H2和生理盐水处理的角膜中巨噬细胞的表型评估A：两组角膜中心组织ED1（红色箭头）和ED2（蓝色箭头）免疫染色的代表性图像。B：外周角膜中ED1阳性巨噬细胞数量条形图；H2治疗显著减少了ED1阳性巨噬细胞的数量。C：周围角膜中ED2阳性巨噬细胞数量条形图。

此外，ED1和ED2免疫染色分别用于检测泛巨噬细胞和M2巨噬细胞的浸润（图5A）。值得注意的是，H2明显减少了ED1阳性泛嗜酸性粒细胞的浸润，而ED2阳性M2巨噬细胞的浸润则明显增加（图5B和5C）。

5.H2对SOD1酶活性的影响

图6 H2治疗后细胞质SOD1表达增加A：碱损伤后伤口愈合过程中SOD1（箭头）免疫染色角膜上皮细胞的代表性图像；B：条形图显示随着时间的推移，SOD1在H2给药过程中被激活；C：条形图显示在损伤后6小时，H2组与生理盐水组和正常角膜相比，中央角膜细胞质SOD1表达显著上调。

为了研究H2对抗氧化酶的潜在影响，我们研究了SOD1的蛋白水平。值得注意的是，H2组角膜上皮细胞的细胞质SOD1水平明显高于生理盐水组（图6A）。这些SOD1水平在注射H2后立即升高，然后随着时间的推移逐渐降低（图6B）。受伤后6小时，H2组角膜中央的SOD1表达相对于未受伤的对照组增加了约4.8倍，而生理盐水组仅增加了1.8倍（图6C）。

讨论：

在碱烧伤的角膜上经常可以观察到强烈的炎症和随后的新生血管。因此，观察到的H2的作用使人们对其在碱引起的角膜损伤中的应用产生了浓厚的兴趣。H2可选择性地减少羟基自由基，而羟基自由基是细胞毒性最强的活性氧。此前，Kubota等人评估了H2在SOD1缺乏的小鼠角膜碱烧伤模型中的作用。他们的研究结果证明碱烧伤的氧化性质，并证明了H2在角膜中的抗血管生成作用。在本研究中，我们观察到的H2抗血管生成作用与Kubota等人的研究结果一致。在我们的实验中，JG12的免疫组化染色显示H2组显著抑制了新生血管的形成。

此外，我们还对浸润受伤角膜组织的炎性细胞进行了详细分析。免疫组化染色显示，在损伤后的所有时间点，H2组浸润的中性粒细胞数量都明显少于生理盐水组。我们进一步观察到浸润性中性粒细胞与8-OHdG阳性细胞之间的关联，并发现H2能显著抑制这两种细胞的数量。由于H2是一种自由基清除剂，我们的研究结果表明，氧化应激的减少可能有助于抑制炎症细胞的入侵，这与之前的报告一致。我们通过使用LV-SEM观察角膜胶原蛋白进一步证实了这一效果，LV-SEM是一种广泛用于评估光镜下组织标本三维超微结构变化的模式。H2有助于维持基质胶原纤维的正常排列，这是角膜透明度的一个重要因素。

我们还观察到H2对巨噬细胞浸润的显著影响。具体来说，用H2处理可显著减少ED1阳性泛巨噬细胞的浸润，同时显著增加ED2阳性M2巨噬细胞的浸润。值得注意的是，M1巨噬细胞是炎症细胞，而M2巨噬细胞能消除炎症，因此在组织重塑和伤口愈合中发挥着关键作用。以往的角膜研究报告表明，M2巨噬细胞在角膜组织的伤口修复过程中发挥作用。因此，我们观察到H2治疗能促进M2巨噬细胞的表达，这表明这种疗法有可能应用于临床。不过，还需要进一步的实验来阐明M1/M2平衡的病理机制。

众所周知，SOD是抗氧化应激途径中的重要角色。在这些酶中，SOD1在大多数组织中表达，其活性占SOD活性的90%。在SOD1缺乏的动物中，自由基诱导的损伤会导致退行性或炎症性疾病。相反，使用灌注法大量增加眼内外源性SOD1的水平似乎能通过解决氧化应激减轻炎症。Murakami等人报道说，用H2处理可通过Nrf2途径诱导SOD，从而间接减轻氧化应激。因此，在本研究中，我们假设SOD1可能参与了H2间接抑制自由基的机制。与这一假设相一致的是，我们观察到角膜上皮细胞的细胞质SOD1在H2的作用下活化，甚至在伤口愈合的早期阶段也是如此。综上所述，这些结果表明，H2的抗氧化作用不仅包括直接清除自由基的作用，还包括激活SOD1的作用，这与之前的一项神经学研究一致，在该研究中，H2被认为是治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的有效候选药物，而肌萎缩性脊髓侧索硬化症涉及细胞质SOD1的突变。

总之，我们对碱诱导的角膜损伤的研究表明，H2不仅通过抑制自由基，还通过诱导SOD1的活化来发挥抗炎作用。进一步了解H2的这些特征性作用可能有助于制定更多的眼科治疗策略。