摘要：

目的：探讨氢(H2)对大鼠角膜碱烧伤模型中铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)活性的影响。方法：每只大鼠的一个角膜接受碱暴露。碱暴露前和碱暴露后，分别在角膜上持续滴注生理盐水(生理盐水组)或氢溶解盐水(H2组)5min。用免疫组织化学方法检测两组摘除眼的炎细胞、新生血管和胞浆SOD1水平。用低真空扫描电子显微镜分析眼内三维超微结构变化。结果：H2组角膜炎症细胞数和血管内皮细胞数均明显减少(P<0.01)。此外，H2处理还可增加角膜上皮细胞胞浆SOD1水平(P<0.01)和活性(P<0.01)。值得注意的是，H2组的SOD1活性水平大约是生理盐水组的2.5倍。结论：H2治疗可抑制角膜损伤后炎症反应和新生血管形成，并通过上调SOD1酶蛋白水平和活性间接抑制角膜氧化损伤。

引言：

自2007年我们首次提出氢气（H2）通过选择性还原细胞毒性氧自由基作为治疗性抗氧化剂以来，已有多项研究证明了氢气的作用，并提出了其在治疗方面的应用潜力。因此，H2医学领域正在迅速发展，目前有超过25项临床研究（包括双盲临床试验）正在评估H2的治疗效果。更具体地说，眼科研究人员已经报道了H2在视网膜动脉闭塞、角膜碱烧伤和白内障超声乳化手术中直接降低氧化应激的应用。但值得注意的是，也有报道称H2可通过其他途径间接抑制氧化应激。

细胞质Cu、Zn超氧化物歧化酶（SOD1）参与抗氧化应激，其活化是H2医学研究中发现的一个途径。SOD1可调节活性氧水平，从而在组织稳态中发挥重要作用。有报告显示，H2参与了SOD1的活性，并认为前者间接抑制了抗氧化应激。但迄今为止，很少有报告描述H2在眼科环境中激活SOD1的作用。

因此，在本研究中，我们通过明确H2对角膜碱烧伤模型中SOD1活性的影响，评估了H2对炎症和新生血管形成的影响，以及对氧化应激的间接影响。

材料与方法：

伦理批准：

所有基于动物的实验均遵照日本医科学校实验动物伦理审查委员会的规定进行。所有程序均符合视觉研究协会和眼科与视觉研究协会的指导方针。

动物：

八周大的雄性Wistar大鼠，体重200克。大鼠饲养在特定的无病原体环境中，12小时光照/12小时黑暗循环。在整个实验过程中提供水和食物，并提供持续的临床护理（每天24小时/每周7天），以确保在需要时及时干预。

碱烧伤模型和H2溶解生理盐水的制备：

在3.5%异氟醚吸入麻醉下，每只大鼠的一只眼睛（共104只）按照以下方案进行碱烧伤：将一张浸泡在1mol/L NaOH中的圆形滤纸放在角膜中央1分钟。在碱暴露前用生理盐水（生理盐水组：39只）或H2溶解生理盐水（H2组：39只）滴注（10mL/min）冲洗角膜5分钟，并在碱暴露后再次冲洗角膜。每只大鼠均以未受伤的正常角膜作为对照。

H2溶解生理盐水的制备方法见我们之前的报告:

简而言之，将市售生理盐水塑料袋放入充满H2气体的丙烯酸真空室中24小时（图1A）。使用前，使用针式H2电极（Unisense，丹麦奥胡斯）确认每个袋中H2的溶解浓度。在所有实验中，溶解了H2的生理盐水都是在从真空室取出后5分钟内使用的。

碱伤后6小时、1天和7天，在3.5%异氟醚吸入麻醉下，对大鼠进行放血安乐死。对去核眼球进行组织学和免疫组化检查，并进行低真空扫描电子显微镜检查。整个实验期间未发现任何不良反应。

组织学和免疫组化分析及LVSEM观察：

将去核眼球（每组/每个终点n=8只）固定在10%的缓冲福尔马林中，用石蜡包埋，然后进行光学显微镜观察。随后，去石蜡组织切片（厚度：2.5μm）用苏木精和伊红（HE）染色，用NaphtolAS-D氯乙酸酯酶（EST）检测浸润的中性粒细胞，并用LV-SEM染色。对于后者，用周期性酸-甲酚胺银（PAM）对组织进行染色，以明确胶原。

为了对炎症细胞、新生血管和SOD1酶水平进行免疫组化分析，在两个角膜区域（中心：3个视野，周边：2个视野）的高倍视野（放大率：400×）中对每个样本的阳性细胞数量进行病理测量。使用的一抗如下

1）单克隆小鼠抗氨基肽酶P抗体（JG12）用于检测血管内皮细胞；

2）单克隆小鼠抗8-OHdG抗体（JaICA）用于检测DNA氧化应激；

3）单克隆小鼠抗CD68抗体（ED1）；

4）单克隆小鼠抗CD163抗体（ED2）检测M2巨噬细胞；

5）多克隆兔抗SOD1抗体（Stressgen）检测SOD1酶。

如上所述，用于LV-SEM的样本需进行PAM染色以增强对比度。用PAM染色后，通过LV-SEM对没有安装盖玻片的标本进行检查。使用15kV的加速电压和30Pa的反向散射电子探测器评估角膜伤口的超微结构变化。

统计分析：

所有结果均以均数±标准差（SD）表示。统计分析使用分析软件程序进行。比较采用学生t检验。当P<0.05时，结果具有统计学意义。