光催化产生H2的测量结果

使用外部光源(350W Xe灯)测量光催化产生的H2。在厌氧室的厌氧条件下，在100毫升血清瓶中准备了20毫升含有1毫摩尔(NH4)2Fe(SO4)2、1毫摩尔NiCl2、100毫摩尔抗坏血酸和5毫摩尔MV2+的LB培养基和工程大肠杆菌细胞。系统被抽空，以去除手套箱大气中的N2和H2。在反应开始后加入IPTG，先后诱导CdS纳米粒子的原位合成和氢化酶的过表达。用微型注射器直接将样品注入气体采样器，然后用气相色谱仪分析产生的H2量。然后将样品注入配备热导检测器的气相色谱仪(Kejie GC5890C，配有硅胶柱和热导检测器传感器)，以同时测定H2、O2和N2的浓度。为了在有氧条件下进行测量，对厌氧条件下制备的反应系统进行了仿生物硅胶封装。

仿生硅胶封装

通过离心收集含有CdS纳米粒子的工程大肠杆菌细胞，然后对其进行Choi等人描述的仿生二氧化硅封装方案。工程细胞在PDADMAC溶液和PSS溶液中交替浸泡，每步5分钟。LbL过程结束后，将多层包裹的细胞放入50mM硅酸溶液中。最后通过离心收获封装的生物杂交聚集体，并均匀分散成2000微米的颗粒。

微电极测量

O2微电极是一种尖端直径为25μm的OX25微电极(Unisense)。通过用O2微电极刺穿聚集的大肠杆菌来检测其体内的O2浓度。新鲜制备的聚合大肠杆菌细胞用于在有氧条件下至少12小时的产氢测量。然后，从反应系统中收获聚集体。将单层聚集体固定在琼脂基底(琼脂重量百分比为1%)上，当微电极尖端刺入聚集体时，微机械手的步长为1μm。

结果

CdS纳米粒子的生物合成

我们首先探索了大肠杆菌细胞对CdS纳米粒子的生物合成。CdS是一种经过深入研究的半导体，其光催化活性已在生物无机杂化系统中得到充分验证。然而，这种半导体的合成需要复杂的工艺和昂贵的试剂。添加的外源金属材料的生物相容性也会影响生物反应器的效率。Yang等人利用非光合细菌Moorella thermoacetica开创了从二氧化碳中光合作用合成醋酸的混合策略，取得了关键性进展，该细菌展示了生物沉淀CdS纳米粒子的独特代谢途径。受Yang及其同事研究的启发，我们意识到，我们先前设计的大肠杆菌细胞表面显示了一种铅特异性结合蛋白PbrR，可能会发挥与Moorella thermoacetica类似的功能。PbrR蛋白含有三个保守的半胱氨酸残基，它们通过独特的半定向几何结构协调铅(II)金属中心。PbrR蛋白在大肠杆菌细胞表面的显示允许选择性吸附铅和镉离子，并在细胞外膜上形成PbS和CdS纳米颗粒。此外，作为基因工程中最重要的微生物，大肠杆菌在基因组和代谢机制方面已得到了深入研究，并已成为合成生物学中最重要的细胞模式。因此，将光合生物杂交系统应用于大肠杆菌细胞是非常可取的，从而扩大了其应用范围。

图2大肠杆菌细胞-CdS混合系统的氢光合作用。(A)工程大肠杆菌细胞详图。(B)工程大肠杆菌细胞表面生物合成的CdS纳米粒子的TEM图像。(C)随机选择的CdS纳米粒子的EDX确认。(D)混合系统在厌氧条件下产生的H2。(E)混合系统在辐照过程中产生H2的速率变化。

随后，我们研究了表面显示PbrR的大肠杆菌细胞，以用于CdS纳米粒子的生物沉淀。我们将先前研究中构建的包括大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)和PbrR蛋白的融合蛋白表达质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中(图2A)。

用阿拉伯糖诱导表面显示的PbrR蛋白的表达，并在培养基中加入Cd2+引发CdS纳米颗粒的生物沉淀。我们使用透射电子显微镜和能量色散X射线光谱(TEMEDX)观察了CdS纳米粒子的沉淀过程。如透射电子显微镜图像所示，镉离子在细胞表面积聚并形成了大小小于50nm的均匀纳米粒子团(图2B)，这在Yang等人对M.thermoacetica-CdS杂交体系的研究中也观察到了。此外，对随机选择的包含部分CdS纳米颗粒的区域进行的EDX分析也证实了其元素组成(图2C)。使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测量了PbrR表达的大肠杆菌细胞表面生物合成的CdS纳米颗粒的数量，24小时后达到8.09±0.70μg/108 cells，该数值远高于未显示PbrR的细胞。这些数据证实了表面显示的PbrR介导的CdS纳米粒子在细胞外膜上的生物沉淀。

大肠杆菌细胞-CdS混合系统的氢光合作用

我们进行了紫外-可见(UV-vis)光谱测量，以直接确定这些CdS纳米粒子的光带隙能以及CdS纳米粒子在细菌细胞外膜上生物沉淀的光催化能力。在太阳光谱的可见光区域检测到了生物合成的CdS纳米粒子的最低能量转变(Eg=2.92eV，λabsorption=424nm)，证实了原位生物合成的CdS纳米粒子的光催化能力。反应溶液中还含有抗坏血酸和甲基维生物素(MV2+)。抗坏血酸通常用作再生CdS纳米粒子的牺牲电子供体。氧化还原染料MV2+是一种成熟的电子介质。结合MV2+，半导体/细菌细胞混合系统很容易成为H2光合作用的生物催化剂。在厌氧条件下测量了各实验组中还原MV的浓度，证实了沉淀在工程大肠杆菌细胞上的CdS纳米粒子能吸附光子并将电子传递给MV2+。利用气相色谱法(GC)检测了该混合系统在厌氧条件下产生的H2量。在无光条件下，由于内源表达的氢化酶介导的厌氧发酵，在有或没有CdS的情况下，工程大肠杆菌细胞产生了微量的H2。然而，在350瓦Xe灯的照射下，携带CdS纳米粒子的工程大肠杆菌细胞(1×108个)在6小时后形成近13.40±1.20μmol H2，24小时后达到81.80±7.39μmol，这一数值明显高于其他处理的数值(图2D)。此外，该杂交系统的H2光合作用速率在最初的18小时内从每小时0.56μmol/108个细胞稳步上升到1.15μmol/108个细胞，随后由于细菌死亡而开始下降(图2E)。根据这些结果，我们的工程大肠杆菌细胞-CdS杂交系统在厌氧条件下产生的H2与生物合成的CdS半导体和全细胞生物催化剂的活性直接相关。