研究简介:大脑虽然只占体重2%，却消耗了近20%的静息能量，其ATP几乎全部由葡萄糖有氧氧化供给。几十年来，神经代谢领域却流传着一个看似矛盾的假设：当神经元突然高频放电时，第一时间并不动用“主发电机”——线粒体氧化磷酸化，而是先启动“应急电池”——糖酵解，尤其是在星形胶质细胞内的糖酵解。本研究利用大鼠海马脑片，结合氧微电极记录、NADH荧光成像及数学建模，系统评估了神经元活动瞬间的能量来源。传统观点认为，神经活动首先由糖酵解（主要在星形胶质细胞）供能，再通过乳酸转运给神经元进行氧化磷酸化。研究却发现在阻断乳酸脱氢酶（LDH）、或仅用20%O₂模拟生理低氧条件下，神经元刺激仍迅速降低胞外O₂和胞内NADH，提示氧化磷酸化被立即动员.药理学逐步阻断突触前动作电位、Ca²⁺内流-递质释放、突触后谷氨酸受体电流及动作电位，可分别减少11%、17%、46%、26%的O₂消耗，证明这些关键信息处理环节均由氧化磷酸化直接供能.阻断LDH后，活动诱发的O₂与NADH变化幅度不变，否定了星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭假说对瞬时能量供给的必要性。该工作颠覆了“先糖酵解后氧化”的传统教条，明确了大脑信息处理主要由氧化磷酸化实时驱动，为理解脑能量代谢及fMRI信号生理基础提供直接证据。

Unisense微电极系统的应用

使用了Unisense Clark型玻璃氧微电极，尖端直径10µm。实现了原位测量海马切片内胞外氧浓度变化，作为氧化磷酸化速率的直接指标。微电极尖端定位于CA1辐射层距锥体细胞层30µm、距切片表面约100µm处。通过Clark型玻璃微电极实现10μm空间分辨率，实时监测刺激诱发的O₂浓度动态变化。量化不同药物（如NBQX、Cd²⁺）对O₂消耗的抑制比例（如突触后机制占72%），为能量分配提供实验依据。

实验结论

研究通过海马脑片多手段实验，首次直接证明神经元活动瞬间所需ATP主要由氧化磷酸化即时提供，而非传统认为的“先糖酵解后氧化”或星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭模式。阻断乳酸脱氢酶或降低氧浓度后，神经元刺激仍迅速耗氧并降低NADH，表明氧化磷酸化被立即动员，承担≥62%的ATP增量。利用药理-建模拆分，11%的氧耗用于突触前动作电位，17%用于Ca²⁺内流-递质释放，46%用于突触后谷氨酸受体电流，26%用于突触后动作电位。抑制LDH不改变刺激诱发的氧耗与NADH变化，否定了星形胶质细胞产乳酸快速供神经元氧化磷酸化的必要性。

图1、刺激诱发的场电位及O₂与NADH变化。A图：实验电极位置及成像区域示意图。B图：左上小图：0.33 Hz刺激下记录的场电位（含突触前动作电位、场兴奋性突触后电位fEPSP及突触后群体峰电位），TTX阻断后仅保留刺激伪迹。主图：TTX阻断前后的差值曲线，显示各成分测量方法（突触前动作电位幅度、fEPSP斜率、群体峰电位幅度）。C图：20 Hz刺激10秒诱发细胞外[O₂]下降（均值118±8μM）。D图：NADH荧光双相响应（初始下降1.4%，后续超调2.4%），在辐射层（s.r.）、锥体层（s.p.）和腔隙层（s.o.）无显著差异。E-G图：各层NADH静息荧光（E）、刺激诱发的NADH下降（F）及超调（G）的定量比较。H图：糖酵解、TCA循环与氧化磷酸化对NADH水平的调控机制示意图。

图2、不同亚细胞机制的O₂消耗药理学分析。A图：实验流程设计（三阶段刺激协议，含药物干预）。B-D图：NBQX+AP5（阻断突触后电流）选择性抑制fEPSP和群体峰电位，对突触前动作电位无影响。Cd²⁺阻断突触传递但保留突触前动作电位，TTX阻断全部电活动。E-G图：逐步阻断突触后活动（NBQX+AP5）、递质释放（Cd²⁺）及全部活动（TTX）使[O₂]下降依次减少63%、82%和100%。NADH下降及超调呈现类似阶梯式抑制。H-I图：谷氨酸（500μM）在Cd²⁺存在下诱发的[O₂]下降，TTX进一步减少29%，表明动作电位消耗O₂

图3、生理O₂水平下氧化磷酸化支持神经活动。A图：20%O₂灌流降低fEPSP（38%）和群体峰电位5%），但不影响突触前动作电位。B图：20%O₂下[O₂]下降幅度减小但持续时间延长（恢复需5分钟）。C图：NADH初始下降及超调幅度在低O₂下降低。D图：标准化后的O₂下降与NADH超调时间重叠。E-F图：NBQX+AP5在95%和20%O₂下对[O₂]下降的抑制比例无差异（63%vs.68%），表明突触后O₂消耗与O₂水平无关。

图4、LDH阻断不影响O₂与NADH初始下降。A图：LDH抑制剂草酸盐使细胞外乳酸减少66%。B图：实验设计（阶段2加入oxamate）。C-D图：oxamate不改变[O₂]下降（E）和NADH初始下降（F），但增加NADH超调（G）（p=0.003），提示糖酵解延迟激活。

图5、巨噬细胞复极化的机制研究。a）接受不同处理的RAW 264.7细胞的RNA测序分析示意图。该图由Figdraw创建。b）来自不同群体的RAW 264.7细胞基因的PCA分析。数据按原样显示（N=3）。c）来自不同组的RAW 264.7细胞转录组中差异表达基因的基因聚集。数据按原样显示，并按平均值显示（N=3）。d）来自不同组的RAW 264.7细胞的炎症相关途径中涉及的DEGs的热图分布。数据按原样显示（N=3）。e）LPS/IFN-γ和LPS/IFN-γ+CSN处理的RAW 264.7细胞转录组中DEGs的火山图。f）LPS/IFN-γ和LPS/IFN-γ+CSN处理细胞的前15个DEGs的相互作用。g）LPS/IFN-γ和LPS/IFN-γ+CSN处理细胞的KEGG富集分析气泡图h）Nfkb2的mRNA表达，来自不同组的RAW 264.7细胞的Mapk12和Tnf。数据表示为SD±均值（N=3）。i）IL-17信号通路的GSEA图显示，用LPS/IFN-γ处理的RAW 264.7细胞CSN处理后显着下调（NES=-1.74）。j）CSN巨噬细胞复极化的分子机制示意图。k）来自不同组的RAW 264.7细胞的p65、p38和FosB的蛋白质印迹分析。

结论与展望

本研究研究了大脑信息处理过程中能量供应的核心机制，挑战了"神经元活动初期依赖糖酵解供能"的传统观点。通过海马体切片实验，研究人员验证了氧化磷酸化（而非糖酵解）是突触前动作电位、神经递质释放、突触后电流和动作电位等关键神经活动的主要能量来源。本研究首次整合Unisense O₂电极、NADH成像和场电位记录，实现多参数代谢-电活动同步分析。通过Clark型玻璃微电极实现10μm空间分辨率，实时监测刺激诱发的O₂浓度动态变化。这一发现对理解脑功能成像（如BOLD信号）的生理基础具有重要意义。本颠覆了“糖酵解先供能”的传统教条，为理解大脑信息处理的能量供应机制、解释BOLD-fMRI信号生理基础提供了直接实验依据。