实验结果

1.慢性感染CF患者分离株产生N2O的研究

铜绿假单胞菌、木糖氧化芽孢杆菌和多食性芽孢杆菌在添加NO3−的厌氧LB培养基中培养1或2天。嗜麦芽窄食单胞菌在添加NO3−或NO2−的厌氧LB液中培养时，不能显著提高N2O浓度。

嗜麦芽假单胞菌不含释放N2O的酶。相比之下，高致病性CF分离株的相应参考菌株显示出较低的N2O产生量，表明致病临床菌株适应肺部感染期间的厌氧呼吸。

2.慢性感染CF患者分离株的生物量积累

生物量的积累可以通过去除O2和补充由吸光度和目测确定的NO2−或NO2−来控制。所有4种分离的病原菌的厌氧培养结果显示，当添加NO3−时，吸光度显着增加，表明所有4种病原菌都具有通过NO3−还原进行厌氧生长的能力。然而，在添加3号的厌氧培养中，铜绿假单胞菌、木糖氧化杆菌和多重嗜麦芽单胞菌在第二天的吸光度明显高于嗜麦芽寡养杆菌，表明嗜麦芽寡养杆菌的生长较慢。添加亚硝酸盐仅显著增加了生物量对于铜绿假单胞菌，表明在亚硝酸盐上有厌氧生长的能力。对参考菌株也观察到了类似的结果。

3.慢性感染CF患者分离株的生长

（从慢性感染的CF患者分离的菌株中观察到的生长情况，在没有添加或添加10 mM NO3−或10 mM NO2−的需氧或厌氧的LB肉汤中生长2天。铜绿假单胞菌12株，木糖假单胞菌9株，多食单胞菌9株，沙门氏菌9株。）

在厌氧培养中加入10 mMN3−，在第1天和第2天铜绿假单胞菌的cfu/ml显著增加，在第1天木糖氧化杆菌的cfu/ml显著增加。相反，添加10 mM的3号并没有显著增加多食杆菌和嗜麦芽寡养杆菌的cfu/ml数量。只有嗜麦芽寡养单胞菌受到补充10 mMNO2−的影响，这导致cfu/ml显著下降。

4.慢性感染CF患者分离株中NO3−和NO2−胞外浓度

对于所有4种病原菌，添加10 mM NO3−的厌氧LB发酵液中的NO3−浓度在第1天和第2天都显著降低，但嗜麦芽寡养单胞菌不能消耗全部NO3−。这表明，在所有物种中都存在由于活性而导致的N3消耗，高致病力的铜绿假单胞菌、木氧杆菌、亚硝酸盐−浓度显著增加。因此，只有高致病性的CF菌株才能将NO3−还原产生的NO2−输出到培养基中。嗜麦芽寡养单胞菌在消耗N3−的过程中胞外NO2−含量没有增加，部分原因可能是同化反硝化作用。显然，只有铜绿假单胞菌能够显著消耗NO2−，这表明该病原菌含有更多的活性亚硝酸盐还原酶。与第1天出现的NO2−快速消耗相反，第2天后NO2−浓度显著降低。这类似于最近在感染的CF痰中发现的并表明NO2−的减少速度慢于N3−的减少速度。

5.嗜麦芽窄食单胞菌比生长速率与细胞核糖体含量的相关性

为了建立细菌生长速度与16S rRNA细胞含量之间的相关性，对生长过程中收集的3株嗜麦芽寡养单胞菌进行了定量PNA FISH(针对嗜麦芽窄食单胞菌核糖体的16S rRNA)，其中对应的计算增长率。这些标准曲线用于估计痰标本中嗜麦芽寡养葡萄球菌的原位生长速度。

6.rRNA杂交法检测慢性感染患者痰中非生长嗜麦芽寡养单胞菌

利用嗜麦芽寡养单胞菌的特定生长率与细胞核糖体含量之间的相关性，首次估计了痰中嗜麦芽寡养单胞菌的原位生长率。有趣的是，根据核糖体数量的减少，在痰中分析的大多数细胞被发现是不生长到生长缓慢的细胞。这些细胞都没有达到从痰标本中分离的细胞在好氧LB发酵液中测得的体外生长速度。这一点得到了共聚焦荧光显微镜的证实。这些痰的生长速度大大低于好氧培养期间，嗜麦芽寡养单胞菌在痰标本中处于休眠状态。

讨论

尽管有几种人类病原体没有反硝化的遗传机制，但反硝化的临床意义一直受到质疑。我们的数据表明，某些革兰氏阴性病原菌在慢性肺部感染期间造成严重的肺损伤能够进行反硝化作用，而嗜麦芽寡养单胞菌没有反硝化作用，导致慢性感染后肺功能不那么严重的下降。

为了证明反硝化作用，我们测量了N2O的浓度，这被认为是厌氧培养中反硝化的真正标标。

对于铜绿假单胞菌来说，在补充亚硝酸盐的过程中，消耗亚硝酸盐和增加生物量的能力进一步证实了该病原菌可以进行反硝化作用。此外，为了用二氧化氮杀死肺部病原体，需要仔细监测补充的二氧化氮是否会导致病原体种群的扩大或减少。相比之下，嗜麦芽寡养单胞菌分离株未能产生N2O，这与缺乏编码已知酶的基因一致，这些酶参与了氮氧化物产生气体的过程。

所有四个物种都表现出NAR活性，表现为在补充N3−期间N3−的生物量和消耗增加，这对应于环境中嗜麦芽寡养单胞菌的NAR酶活性，临床嗜麦芽寡养单胞菌的nar基因，以及三个高度致病菌株中描述良好的遗传结构。嗜麦芽假单胞菌的低厌氧生长可能与嗜麦芽寡养单胞菌不能利用反硝化作用进行N3−的厌氧呼吸有关，表现为不能完全消耗N3−，同时缺乏NO2−的积累和N2O的产生。然而，在补充NO3−的过程中适量地消耗NO3−和诱导生长，以及反硝化途径中NAR下游活性酶的生物标志物的缺乏，表明嗜麦芽假单胞菌能够通过N3−的呼吸而生长，而不需要进一步减少末端电子受体的步骤。

因此，嗜麦芽寡养单胞菌中nar基因的表达降低。在厌氧条件下也可以解释观察到的生长较慢的原因，但有待进一步研究。此外，我们推测嗜麦芽窄食单胞菌的厌氧持久性是否也受到发酵过程的支持，在铜绿假单胞菌中，精氨酸或丙酮酸促进了厌氧生长或存活。

综上所述，本研究通过反硝化厌氧生长的能力，从低致病力嗜麦芽寡养单胞菌，到高致病性的铜绿假单胞菌、木氧杆菌和多食芽孢杆菌。提示反硝化作用可能参与了慢性肺部感染时革兰氏阴性菌的致病作用。