目的：慢性铜绿假单胞菌肺部感染是囊性纤维化（CF）患者最严重的并发症。CF患者受感染的支气管内粘液含有厌氧区，主要是由于多形核白细胞的呼吸爆发。我们最近证明了铜绿假单胞菌感染患者的痰液中存在持续的反硝化作用。因此，我们的目的是研究几种已知CF病原体的致病性是否与其反硝化能力相关。

方法：我们使用一氧化二氮(N2O)微电极测量反硝化作用，并通过吸光度变化和菌落计数对来自32名慢性感染高致病性细菌铜绿假单胞菌、木糖氧化无色杆菌、多食伯克霍尔德菌或低致病性细菌嗜麦芽寡养单胞菌的CF患者的分离株进行厌氧生长测量。估算NO3-和NO2-的消耗量，所有分离株均在含有NO3-或NO2-的厌氧LB肉汤中培养2天进行测定。16S rRNA的PNA FISH染色用于估计每个细菌细胞的核糖体量，从而估计痰中嗜麦芽糖链球菌的原位生长率。

结果：补充NO3-导致5铜绿假单胞菌、木糖氧化放线菌和多食芽孢杆菌产生N2O增加，并促进所有病原体的生长。然而，嗜麦芽糖链球菌的生长速度最低。NO3-被所有病原体代谢，但只有铜绿假单胞菌能够去除NO2-。通过弱PNA FISH染色可以看出，嗜麦芽糖链球菌在痰中的生长有限。

结论：所有四种病原体都能够通过NO3-还原进行厌氧生长。然而，在嗜麦芽糖链球菌分离株中并未发现N2O产生所证明的反硝化作用。进行反硝化的能力可能有助于传染性分离株的致病性，因为完全反硝化促进更快的厌氧生长。嗜麦芽糖链球菌无法通过反硝化作用增殖，因此无法在厌氧CF痰中生长，这可能解释了其对CF患者的低致病性。

前言:

囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传病，铜绿假单胞菌、木糖嗜铬杆菌、多食伯克霍尔德氏菌和嗜麦芽窄食单胞菌等革兰氏阴性杆菌可引起CF患者呼吸道慢性感染。铜绿假单胞菌、木糖拟单胞菌和多食单胞菌会导致慢性肺炎组患者在慢性感染后肺功能严重恶化。慢性嗜麦芽窄食单胞菌感染的肺功能恶化较慢，甚至长期稳定。

铜绿假单胞菌慢性肺部感染的主要致病菌，存在于支气管内粘液中被多形核白细胞(PMN)包围的生物膜聚集体中，其中包含厌氧区。这种厌氧主要是由宿主细胞引起的，因为中性粒细胞为了产生超氧化物而强烈消耗氧气，其次是产生一氧化氮(NO)和肺上皮呼吸，而微生物需氧呼吸消耗的氧气很少。尽管有厌氧菌，铜绿假单胞菌仍在支气管内分泌物中生长并持续存在。这种厌氧生长提供能量的机制显然包括反硝化作用，因为支气管内分泌物中持续产生一氧化二氮(N2O)以及反硝化标志物OprF porin，而且痰和气管吸出物中的氨浓度随着抗菌治疗而降低。精氨酸发酵也可能有助于铜绿假单胞菌的生存，尽管其能量产量远低于好氧或无氧呼吸。在好氧生长过程中也可能发生反硝化作用，尽管反硝化作用的速率与O2浓度成反比。

反硝化作用可能有利于铜绿假单胞菌的生物膜粘液表型，这种表型是慢性感染的特征，因此在CF中具有高致病性，并可能促进生长，并增加对抗生素的耐受性。因此，反硝化作用可能与慢性铜绿假单胞菌肺部感染的致病性有关。

本研究中使用的三个高致病性分离物已知有能力将NO2−还原到亚硝酸盐(NO2−)之外，但对嗜麦芽窄食单胞菌没有。因此，通过比较高致病性铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食杆菌、多食杆菌和低致病性嗜麦芽窄食单胞菌的反硝化作用，我们推测反硝化作用与病原菌的致病力有关。反硝化被量化为N2O的缺氧释放，这是反硝化的标志，在添加了N3−和NO2−的慢性感染的CF患者中分离的N2O微电极进行了反硝化，此外，通过传统的生长测定方法以及新开发的PNAFISH染色技术来确定NO2−和NO2−对厌氧生长的影响。

材料和方法：

病人：四种病原体的慢性感染：在痰标本培养中检测到细菌超过6个月，或在抗体反应增强的情况下，在较短的时间内检测到细菌的存在。

痰标本:本研究对3例慢性嗜麦芽窄食单胞菌感染患者在放弃知情同意的情况下获得口服许可后，取痰作常规细菌学检查。

细菌:12株铜绿假单胞菌Cf分离株，9株木霉Cf分离株，9株多食杆菌Cf分离株和7株嗜麦芽寡养单胞菌Cf分离株.

刮取细菌被稀释在100ml肉汤培养24h(150rpm，37◦C)。在分光光度计中记录OD600，50ml培养物在磷酸盐缓冲盐水中洗两次，然后5000rpm，4◦C，10min。将小球重新悬浮在5ml PBS中。实际细菌含量通过在蓝色平板上电镀0.9%氯化钠的连续稀释的CFU计数来估计。

媒介：用KNO3或NaNO2添加LB肉汤，以获得10 mM的最终浓度。然后将培养基经无菌过滤(0.2 L)至50ml用半透膜密封的试管中，然后置于37◦C的缺氧气氛中72h。

慢性感染CF患者细菌分离株的厌氧处理：在缺氧条件下将过夜培养物接种到含有10 mM KNO3或10 mM NaNO2的LB肉汤中，以达到2ml中≈106CFU/ml的最终浓度。玻璃瓶放置培养24和48h(150rpm，37◦C)。

生长测量：在测量N2O之前，将玻璃瓶放置在双光束分光光度计中，并测量OD600。以Lb肉汤作为参照物。在N2O测量后，通过在蓝色琼脂平板上连续稀释0.9%的氯化钠来估计样品的菌落形成单位(CFU)。

N2O的微传感器测量：将玻璃瓶放置在加热的金属架上，保持在37◦C下，用安装在电动PC控制轮廓装置中的电流型N2O微型传感器记录N2O浓度。微传感器(尖端直径100m)手动放置在样品中。

通过在实验温度和盐度下测量不含N2O的PBS中的传感器信号以及在PBS中顺序添加已知体积的N2O不同浓度来线性校准N2O微传感器。饱和PBS中的N2O浓度是根据微量气体计测量的N2O溶解度来估计的。

NO3−和NO2−定量测定:NO3−标准曲线用于测定总NO3−和NO2−浓度，而NO2−标准曲线用于单独测定NO2−。NO2−浓度减去总NO3−浓度和NO2−浓度即可估算出NO3−浓度。

增长率的测量：从痰中分离出的嗜麦芽寡养单胞菌在37◦C的LB发酵液中获得了纯培养生长率。将过夜的嗜麦芽寡养单胞菌培养物稀释到250ml烧瓶中的100mlLB肉汤中，在200rpm至OD600=0.05时，允许培养物增殖(37◦C，200rpm)。当OD600达到0.5时，培养物被稀释到OD600为0.05，通过监测OD600随时间的变化来测量后增长率。生长率用比生长率(每小时数)表示。

嗜麦芽寡养单胞菌的固定化：将分离的嗜麦芽寡养单胞菌L固定在一滴固定液中，混合在显微镜载玻片上。固定细胞在65◦C下，在数字干浴上孵育20分钟。将咳出的痰固定在一次性乙烯基样模中。固定样品用−80◦C己烷(SIGMA)快速冷冻。

痰标本的冰冻切片：将快速冷冻的块在−18◦C低温恒温器上切成8um厚的切片。切片固定在显微镜载玻片上。

全细胞杂交：将一滴嗜麦芽寡养单胞菌的探针加到固定的嗜麦芽寡养单胞菌的玻片上，盖上22 mm×22 mm的盖片，55◦C孵育90min，然后在4ml60×洗涤液中孵育30min，洗涤液稀释到240mlMilliq H2O中，然后在黑暗中风干15min。此外，对于痰标本，加入100 L Syto 59(Invitgen)1000×氯化钠溶液进行染色，然后孵育15min，然后进行PBS漂洗和黑暗中风干。在幻灯片上加一滴硬质安装介质，用盖片密封，风干10分钟。

显微技术和图像分析:用蔡司显微镜以及随附的蔡司软件扫描安装的样品载玻片。荧光成像采用63×1.4油物镜，使用免费软件Image J(美国国立卫生研究院)对单个细胞的荧光进行量化。细胞和背景信号之间的区别是通过使用图像J的自动“多阈值”宏阈值来完成的。为了定量，使用了Image J函数“分析粒子”。对于每个被分析的菌株，我们使用17,000平均荧光强度单位作为区分生长和不生长的最低检测下限。