8.Hm保护细胞免受辐射损伤

图5：6Gy辐射24小时后，氢气保护IEC-6细胞免受辐射诱导的损伤。(A)6Gy辐射24小时后IEC-6细胞的相位对比图像。(B)辐射6Gy后24小时死亡细胞Hoechst染色的代表性显微照片。(C）辐射6Gy后24小时，坏死细胞PI染色的代表性显微照片。(D)用附件素V-PI染色细胞，并用流式细胞术分析6Gy剂量辐射后24小时的细胞，凋亡细胞的直方图以占总细胞的百分比表示。(E）细胞存活率直方图以各组的OD值。

相位对比图像显示，辐射诱导的细胞缩小了，而氢气处理阻止了这种变化（图5A）。此外，我们还使用了两种方法来证实氢气也能防止细胞损伤：Hoechst（死亡细胞）和PI染色（坏死细胞）。此外，我们还通过流式细胞术对细胞凋亡进行了定量评估。与Rc组相比，Rh组的IEC-6细胞凋亡率降低了两倍（图5D）。此外，我们还测量了细胞存活率，并证实Hm处理可保护细胞存活率（图5E）。

9.Hm对6Gy辐射后线粒体凋亡途径的影响

图6：氢气缓解线粒体去极化并调节线粒体凋亡途径。(A）用JC-1染色IEC-6细胞，并用荧光显微镜测定线粒体膜电位的变化。此外，在给予6Gy辐射30分钟后，用流式细胞仪量化红/绿荧光密度比。B)在6Gy辐射处理后6小时，对线粒体（Mito）和细胞质（Cyto）中的细胞色素c（CytC）进行Western印迹分析。(C)在6Gy辐射后6小时，对裂解的caspase-9、裂解的caspase-3和RARP进行Western印迹分析。(D)在接受6Gy辐射6小时后，还对Bax、Bcl-2和Bcl-xl进行了Western印迹分析。

还通过荧光显微镜和流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP），探讨了氢气对辐射诱导的细胞凋亡的保护作用。与S组相比，受到辐射刺激的细胞显示出更高水平的绿色荧光强度和更低水平的红色荧光强度，这表明辐射照射后MMP明显降低。然而，用Hm处理明显阻止了MMP的下降（图6A）。

线粒体凋亡途径包括细胞色素c的释放以及caspase-9、caspase-3和PARP的活性。在我们目前的研究中，辐射导致细胞色素c释放到细胞质中（图6B），随后caspase-9、caspase-3和PARP被激活（图6C）。然而，Hm的存在明显阻止了这些变化。

讨论：

在本研究中，我们证实：(1)氢气处理减轻了暴露于WR的小鼠的肠道损伤并改善了肠道功能；(2)氢气处理抑制了暴露于WR的小鼠的氧化应激损伤和全身炎症反应；(3)氢气处理抑制了暴露于WR的小鼠的细胞凋亡并维持了肠上皮细胞的增殖；(4)氢气处理可防止IEC-6细胞在6Gy辐射剂量下形成ROS；(5)氢气处理可保护IEC-6细胞免受辐射引起的损伤；(6)氢气处理可缓解IEC-6细胞在6Gy辐射剂量下的线粒体去极化并阻断线粒体凋亡途径。

RT引起的肠道损伤是癌症患者面临的一个重要临床问题。RT的目标是在对肿瘤细胞产生最大毒性的同时，限制对周围正常组织的伤害。科学家们不断寻找新的、高效且无毒的药物，包括用于放射保护的抗氧化剂。目前，大量数据表明，氢气可选择性地还原-OH，从而有效保护组织免受氧化损伤。与其他抗氧化剂相比，氢气有几个独特的优点：(1)它的副作用最小，因为它存在于人体和大气中；(2)它性质温和，不会干扰新陈代谢的氧化还原反应，也不会破坏参与细胞信号传导的ROS；(3)它的分子量最小，能轻易穿透细胞膜，靶向细胞器，包括线粒体和细胞核。由于这些独特的优势，氢气具有理想的辐射防护特性，此前已有多部著作描述了氢气对辐射引起的器官损伤以及心肌、胃肠道和造血干细胞的保护作用。

肠粘膜是易受辐射损伤的组织。辐照后，肠粘膜坏死会导致进食障碍、严重营养不良，危重者甚至死亡。目前的研究表明，氢气有助于维持肠粘膜的完整性，降低DAO和iFABP的水平，而DAO和iFABP都是肠粘膜损伤的敏感标志物（图2D和E）。此外，氢气处理还能增加小鼠的进食量和体重，并最终减少小鼠的死亡，表明氢气可能对辐射引起的肠道损伤有保护作用（图1B、C和D）。同样，XiaoHW等人在2018年证明，口服灌胃氢水可增加食物摄入量和存活率，维持肠黏膜的完整性，从而改善辐射诱导的胃肠毒性。除了抗氧化能力，作者还重点研究了氢气对肠道微生物群的影响。

有报道称，氢气可减少心肌和造血干细胞在WR后的氧化应激损伤。辐射过程中产生的ROS暴发在辐射引起的肠道损伤的发病机制中起着至关重要的作用。本实验表明，氢气可降低脂质过氧化标志物MDA的水平，减少由-OH引起的DNA氧化的主要产物之一8-OHdG，提高细胞内源性重要抗氧化酶SOD的活性，抑制中性粒细胞聚集指标MPO的活性（图3A、B和F），从而部分恢复了相对较低的抗氧化能力，缓解了氧化/还原平衡的破坏。我们将这种利用外源性氢处理来减少氧化和还原失衡的细胞保护新方法称为"氢复苏"。

肠道辐射损伤引起的肠道细菌转运将导致系统性炎症反应。在我们目前的研究中，氢气的输送也抑制了血清中TNF-α和IL-6水平的升高，这表明氢气在一定程度上阻止了系统性炎症反应的发生（图3C-E）。

科学家们已经证明，细胞过度凋亡是导致RT引起的消化道综合征的主要病因之一。在本研究中，我们证明氢气可减少小鼠暴露于致死剂量为10Gy的WR诱导的细胞凋亡。肠隐窝增殖可促进细胞向上迁移，并产生填充绒毛的终末分化细胞，这些作用必须发生才能使肠粘膜从损伤中恢复。在我们的研究中，虽然辐射导致细胞增殖率急剧下降，但氢处理却能维持细胞增殖，这可能会促进肠粘膜从辐射引起的损伤中恢复过来（图2A-C）。

在体外实验中，我们选择了常用于研究辐射引起的肠道损伤的IEC-6细胞系，以研究氢气的保护作用及其内在机制。在体内，由于ROS的高反应性和短半衰期，很难捕获和测量ROS。在本研究中，我们使用了两种经典的荧光探针（DCFH-DA和DHE）来研究氢气对辐射诱导的ROS在体外形成的影响。我们的研究表明，氢气处理能显著抑制ROS的激增（图4A-C），这可能是氢气防辐射的基本作用机制。

这些结果与Zhang等人的研究结果一致，他们证明富氢培养基可降低体外4GyIR剂量下骨髓细胞的ROS水平和DNA损伤。为了与动物实验保持一致，我们还研究了氢气对辐射诱导的细胞损伤的影响。通过Hoechst和PI染色结果以及流式细胞术分析，我们的研究表明氢气处理可减少细胞凋亡并维持细胞活力，这表明氢气可保护IEC-6免受辐射诱导的细胞损伤（图5A-E）。

以往的研究表明，辐射诱导的ROS过度产生是通过线粒体通透性转换机制放大的。由于氢在所有元素中分子量最小，因此很容易渗透到线粒体中，保护线粒体免受氧化损伤。因此，我们假设氢气可能通过线粒体保护对辐射引起的损伤具有细胞保护作用。首先，我们目前的研究表明，氢气可明显缓解辐射诱导的线粒体去极化，并维持线粒体凋亡蛋白。此外，本研究还对涉及线粒体途径的促凋亡分子的活性进行了研究。

细胞色素c是一种保存完好的电子传递蛋白，是线粒体膜间隙呼吸链的一部分。在我们目前的研究中，辐射刺激导致细胞色素c释放到细胞质中，进而激活caspase-3、caspase-9和PARP，最终导致细胞凋亡。我们的研究表明，氢气可阻止细胞色素c的释放，并抑制caspase-9、caspase-3和PARP的过度激活。

此外，我们还研究了与线粒体凋亡途径相关的Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表达。Bax蛋白从细胞质转位到线粒体是触发死亡信号的关键步骤，而Bcl-2和Bcl-xl可通过阻止细胞色素c从线粒体释放来防止细胞凋亡。我们目前的研究还表明，氢气能阻止Bax的表达增加，减少Bcl-xl和Bcl-2L的表达，这与之前的研究一致。所有这些研究都表明，氢气可能由于参与阻断线粒体凋亡途径而发挥保护作用（图6C、D和E）。

重要的是，我们的研究显示氢气的治疗时间窗相对较窄。我们目前的研究提供的证据表明，一旦在辐射后30分钟给药，氢气的治疗效果就微乎其微，这意味着氢气的预防效果可能比治疗效果更有效。

总之，我们的研究同时证明，氢气对辐射引起的肠道细胞损伤具有明显的保护作用。在体外，我们的研究表明氢气的保护作用与阻断线粒体凋亡途径有关。由于氢气的独特优势，开发与氢气相关的抗氧化方法来治疗辐射诱导的消化道综合征也许是有可能的。