组织病理学分析：

将固定的空肠近端包埋在石蜡中，用显微切片机切成5-μm的切片，然后用苏木精和伊红（HE）染色。在小鼠安乐死前2小时给小鼠静脉注射5-溴-2′-脱氧尿苷，并按照之前描述的方案对空肠近端进行BrdU检测。根据试剂盒说明书，使用CardioTACS原位细胞凋亡检测试剂盒。

测量血浆中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、二胺氧化酶(DAO)和肠道脂肪酸结合蛋白(iFABP)的水平：

使用比色夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测血浆中DAO、iFABP、TNF-α和IL-6的水平。iFABP、TNF-α和IL-6的水平用pg/ml表示，DAO的水平用U/ml表示。

丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）、8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）和超氧化物歧化酶（SOD）测定：

肠道组织中MPO、SOD和MDA的含量使用商业试剂盒进行测量；8-OHdG也使用商业试剂盒进行测量。MDA含量以pg/mg表示，8-OHdG含量以ng/mg表示。肠组织中MPO和SOD活性以U/mg表示。所有样本均检测三次。

测量线粒体膜电位:

将细胞加入0.5毫升JC-1工作溶液（线粒体膜电位检测试剂盒），然后在37°C培养箱中培养20分钟。测量时，采用荧光显微镜观察荧光强度，采用流式细胞术定量红/绿荧光的比值密度。

制备细胞质总提取物和线粒体:

按照之前的描述，裂解IEC-6细胞系并制备细胞质提取物。从IEC-6细胞系中纯化线粒体的方法如其他文献所述。简言之，将IEC-6细胞置于100μl冰冷的线粒体裂解缓冲液中培养，并在冰上用杵匀浆。匀浆在4°C下以1000×g离心5分钟。然后收集上清液，在3500×g、4℃条件下离心10分钟，得到细胞液（上清液）和线粒体（沉积物）部分。

测定培养的IEC-6细胞中ROS的形成情况：

用ROS荧光探针-二氢荧光素（DHE）和荧光探针2′,7′二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色，测定培养的IEC-6细胞中ROS的形成。测量时，使用荧光显微镜观察荧光强度，使用流式细胞仪量化红/绿荧光密度比。

Western印迹分析：

细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并在冰上用细胞裂解缓冲液（蛋白浓度用双喹啉酸蛋白测定法）将样品（每道30微克）电印在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗Bax抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-Bcl-xl抗体、抗细胞色素c抗体、抗裂解的caspase-3抗体、抗裂解的caspase-9抗体、抗COX-IV抗体或抗β-肌动蛋白抗体。然后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温下孵育膜2小时，并用增强化学发光（ECL）试剂。

评估细胞活力和凋亡：

辐射后24小时，使用AnnexinVFITC/PI双重染色细胞凋亡检测试剂盒通过Annexin-V和碘化丙啶（PI）染色测定细胞凋亡。此外，我们还在DMI3000B荧光显微镜下用1mMPI（死细胞标记为粉红色）和5mMHoechst33342（死细胞和活细胞标记为蓝色）对双染色细胞进行人工计数，以评估细胞存活率。此外，还使用AlamarBlue®细胞活力试测定细胞暴露于辐射后的活力。细胞活力以光密度（OD）表示，与活细胞数量成正比。

统计分析：

统计分析采用SPSS21.0Windows软件数据以平均值±SD表示。对于单项比较，我们使用非配对双尾学生t检验；对于多项比较，我们使用方差分析（ANOVA）。受体存活率用Kaplan-Meier法绘制，组间差异用log-rank检验分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

结果：

1.注射HS能明显增加肠道组织中的氢浓度

图1：小鼠暴露于致死剂量全身辐射（WR）后的氢浓度与体重（BW）、食物摄入量和存活率。(A)施用Hs后肠粘膜氢含量的时间变化。(B）两组小鼠在服用致死剂量WR后15天内全部死亡。然而，氢气明显延迟了小鼠的死亡时间。(C）所有小鼠在WR后体重都急剧下降，而Rh组的体重总是明显高于Rc组。(D）监测三只小鼠全天的进食量，数据以克/3只小鼠/天表示。在服用致死剂量的WR后，食物摄入量持续减少；然而，Rh组的食物摄入量远远高于Rc组在相应日期的食物摄入量。

通过氢微电极测量肠组织中的氢含量。图1A显示，肠组织中的氢浓度在注射Hs后约5分钟达到峰值，25分钟后逐渐恢复到正常水平。这些结果表明，静脉注射Hs能有效地将氢气输送到肠道组织中（图1A）。

2.Hs处理可改善暴露于致命剂量WR的小鼠的肠道功能，并提高其存活率。

当小鼠接受的辐射剂量超过14Gy时，大量克隆原丢失会导致隐窝-绒毛系统崩溃和粘膜剥脱，最终因消化道综合征而死亡。研究人员调查了Hs对小鼠在15GyWR剂量照射后存活的治疗效果。服用Hs后，小鼠的死亡时间明显推迟（图1B）。

暴露于致死剂量的WR后，在最初的四天里测量了体重，这是衡量肠道功能的一个粗略指标，直到小鼠开始死亡。在这项研究中，小鼠的体重在受到辐射照射后持续下降。然而，Rh组小鼠的体重明显高于Rc组（图1C）。食物摄入量是对肠道功能的直接测量。在本研究中，我们发现Rh组小鼠的摄食量远高于Rc组（图1D）。

3.Hs处理减轻了亚致死剂量WR对肠粘膜造成的损伤

图2：氢气可减少辐射引起的肠粘膜损伤。(A)HE染色：比较辐射后96小时的肠粘膜结构。(B)BrdU染色：辐射导致细胞增殖减少，氢气阻止了这种变化。(C)TUNEL染色：辐射导致TUNEL阳性细胞迅速增加，氢处理阻止了这一变化。(D)在暴露于亚致死剂量WR24小时后分析血浆中iFABP和(E)DAO的水平。

Rc组小鼠出现明显水肿，隐窝明显消失，绒毛明显缩短。然而，Hs能明显减轻亚致死剂量WR造成的损伤（图2A）。

4.在暴露于亚致死剂量WR的小鼠中，Hs处理可抑制细胞凋亡并维持肠上皮细胞增殖

隐窝增殖可促进细胞向上迁移，并产生终末分化的细胞填充绒毛，从而使肠粘膜从辐射引起的损伤中恢复过来。BrdU染色显示，在暴露于亚致死剂量WR 24小时后，隐窝开始增殖。与S组相比，Rc组增殖的隐窝数量显著减少。然而，Rh组小鼠的增殖隐窝数量高于Rc组（图2B）。

小肠隐窝上皮细胞是最易受辐射诱导凋亡影响的细胞之一。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍末端标记（TUNEL）染色法用于比较暴露于亚致死剂量WR24小时后的细胞凋亡情况。在辐照小鼠中观察到TUNEL阳性细胞急剧增加，而在Rh组中TUNEL阳性细胞较少（图2C）。

5.Hs处理可降低暴露于亚致死剂量WR的小鼠血浆中DAO和iFABP的水平

iFABP和DAO是肠粘膜损伤的两种敏感而特异的标记物，只存在于肠粘膜细胞内。一旦肠粘膜受到损伤，这些标记物就会释放到血液中。图2D和2E显示，在亚致死剂量WR作用24小时后，Hs处理显著降低了iFABP和DAO的水平。

6.Hs处理可缓解暴露于亚致死剂量WR的小鼠的氧化应激损伤和全身炎症反应

图3.氢气降低了小鼠的氧化应激和全身炎症反应。(A)SOD、(B)MDA、(C)8-OHdG、(D)TNF-α、(E)IL-6和(F)MPO在接触亚致死剂量WR24小时后进行分析。

SOD是一类内源性抗氧化剂，它通过自身被氧化来抑制或延缓氧化过程，这对减少氧化应激损伤非常重要。图3A显示，在亚致死剂量WR作用24小时后，Rh组的SOD活性高于Rc组。

MDA是氧化应激引起脂质过氧化的标志。辐射会导致MDA含量明显增加，而氢处理会明显降低MDA浓度，这表明氢保护了脂质免受过氧化（图3B）。

此外，我们目前的研究表明，辐照会导致8-OHdG的积累，而8-OHdG是-OH引起DNA氧化的主要产物之一。氢处理减少了8-OHdG的积累，表明氢能保护核DNA免受氧化（图3C）。

辐射是一种多因素的病理损伤，会导致炎症分子激增。在本研究中，我们重点研究了两种关键的炎症分子：TNF-α和IL-6。氢气处理明显降低了亚致死剂量WR24小时后血浆中TNF-α和IL-6的水平（图3D和3E）。

MPO占中性粒细胞干重的5%。因此，MPO活性可用于估计组织中的中性粒细胞数量。图3F显示，在施用亚致死剂量的WR24小时后，氢处理显著降低了肠组织中的MPO活性。

7.Hm可抑制6Gy辐射后IEC-6细胞中ROS的形成

图4：氢气抑制6Gy辐射后30分钟IEC-6细胞中ROS的形成。(A)用DCFH-DA（绿色）和Hoechst33342（蓝色）共同染色IEC-6细胞，然后用激光扫描共聚焦显微镜观察。绿色荧光的强度与ROS的数量呈正相关。(B)用流式细胞仪量化的ROS水平分布代表图。根据流式细胞仪的结果得出ROS水平的直方图。(C)用DHE（红色）和Hoechst33342（蓝色）共同染色IEC-6细胞。红色荧光的强度与ROS的数量呈正相关，Hoechst33342染色用于量化细胞数量。

为了确定氢作为自由基清除剂的能力，我们通过两种荧光探针比较了IEC-6细胞受到辐射后ROS的形成：DCFH-DA和DHE。一旦细胞用DCFH-DA染色，ROS形成的细胞表现出绿色荧光。在我们的研究中，用氢处理的细胞显示出较低水平的绿色荧光密度（图4A）。此外，我们还通过流式细胞术对ROS水平进行了量化。我们的数据显示，氢处理明显抑制了ROS形成的瞬时增加（图4B）。

此外，IEC-6细胞还标记了另一种ROS荧光探针DHE探针。通过红色荧光强度评估ROS的形成。结果表明，氢处理能明显降低辐射诱导的红色荧光强度（图4C）。