摘要：

众所周知，小肠对辐射特别敏感，放疗的主要限制因素是用药后出现的胃肠道综合征。辐射的有害影响主要是通过过量产生活性氧（ROS），尤其是羟自由基（-OH）来介导的。由于氢气是一种选择性-OH清除剂，我们假设氢气可能对辐射引起的肠道损伤具有保护作用。在此，我们在小鼠和肠隐窝上皮细胞（IEC-6）系中建立了辐射模型。在动物实验中，我们证明富含氢气的生理盐水能显著减少辐射引起的肠粘膜损伤，改善肠道功能，提高存活率。此外，氢气处理还减轻了辐射引起的氧化应激损伤和全身炎症反应。此外，氢气处理还能减少细胞凋亡，维持小鼠肠上皮细胞的增殖。使用IEC-6细胞系进行的体外实验表明，富氢培养基能显著抑制ROS的形成，维持细胞活力，抑制细胞凋亡。重要的是，氢处理可防止线粒体去极化、细胞色素c释放以及caspase-3、caspase-9和PARP的活性。此外，Bcl-xl和Bcl-2蛋白表达的减少以及Bax蛋白表达的增加也被阻断。

引言：

放射治疗（RT）是癌症多模式治疗的一个重要方面，在根除恶性细胞方面发挥着重要作用，但也不可避免地会对正常组织造成损伤。胃肠道（GI）黏膜是对辐射反应较早的组织，因为其增殖迅速且持续不断。据估计，大约50%的接受RT治疗的患者会出现长期慢性消化道症状，影响其日常活动。

由于肠隐窝细胞增殖迅速且持续不断，因此最容易受到辐射的影响。据报道，低至1Gy的辐射剂量可导致小鼠小肠隐窝细胞凋亡在辐射照射后3-6小时内急剧增加。以往的研究表明，辐射诱导的细胞凋亡与线粒体凋亡途径有关，线粒体凋亡途径的特点是细胞色素c的释放以及caspase9和多（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的活性。

辐射对生物组织的有害影响主要是通过增加活性氧（ROS）的产生来介导的。研究报告指出，线粒体在放大和传递导致产生ROS的信号方面起着核心作用。这些自由基的半衰期极短，但它们会立即与附近的分子发生反应，产生严重的特定部位氧化损伤，破坏细胞功能，甚至杀死细胞。在辐射产生的ROS中，-OH是一种高活性产物。据估计，辐射诱导的细胞损伤有60-70%是由-OH引起的。科学家们已经证明，-OH的寿命很短，在发生反应前仅能停留约9-10秒，扩散约4纳米。此外，-OH造成DNA损伤只需要一毫秒的时间。遗憾的是，到目前为止，还没有已知的-OH内源解毒系统。

氢气是一种新型能源，最近大量研究都集中在氢气作为储能介质的能力上。2007年，Ohsawa等人提供的证据表明，吸入氢气可以通过选择性地减少-OH来保护大脑免受缺血/再灌注（I/R）损伤和中风的影响，这表明氢气作为一种治疗气体，可以专门针对-OH发挥独特的功能。由于-OH是辐射诱导的细胞损伤的主要原因之一，而氢气是一种选择性-OH清除剂，因此我们利用细胞培养和动物实验系统研究了氢气对辐射诱导的肠道损伤的保护作用。

材料与方法：

动物和细胞系：

雄性C57BL/6小鼠年龄为8-10周，体重为20-25克，被饲养在单独的笼子里，置于12小时光照/黑暗循环的恒温室中，可自由获取食物和水。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》经第二军医大学动物护理和使用委员会批准。

肠上皮细胞-6（IEC-6）是一种肠隐窝上皮细胞系，取自美国模式培养物保藏中心（CRL-1592），在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜氏改良老鹰培养基中培养。细胞在37℃、5%CO2加湿培养箱中培养，培养基每24小时更换一次。

制备富氢盐水（Hs）和富氢培养基（Hm）：

氢气在生理盐水（Ps）或培养基中高压（0.4兆帕）溶解，使用氢气产生装置持续6小时使其达到饱和浓度（大于0.6毫摩尔/升）。本研究中使用的Hs和Hm是在实验开始前制备的。氢气微电极（MicroResp，丹麦Unisense公司）用于测量氢气溶液和肠粘膜中的氢气浓度。

实验设计：

在我们的体内研究中，第一部分用于测量体重（BW）、食物摄入量和存活率。24只小鼠被平均随机分为两组：辐射组（Rc组，15Gy全身辐射(WR)+Ps）和辐射加氢处理组（Rh组，15Gy全身辐射+Hs）。WR前5分钟腹腔注射Hs或Ps（10毫升/千克体重）。每天记录小鼠的进食量和体重，直到小鼠开始死亡，并每隔24小时监测小鼠的存活率。

体内研究的第二部分旨在进行组织病理学分析和分子检测。36只小鼠被平均随机分为三组：Sham组（S组，无辐射但有Ps）、辐射组（Rc组，10Gy辐射+Ps）和辐射加氢处理组（Rh组，10Gy辐射+Hs）。在放射治疗前5分钟给小鼠注射Hs或Ps（静脉注射）。三组中的六只小鼠分别在24小时和96小时接受10GyWR后安乐死。

设计了一项利用细胞培养进行的原位研究，以测量ROS的形成、细胞凋亡和存活率。在实验过程中，细胞也被分为三组：空白组（S组，无辐射+正常培养基）、辐射组（Rc组，6Gy辐射+正常培养基）和辐射加氢处理组（Rh组，6Gy辐射+Hm）。如前所述，Rh组细胞与Hm一起在充满富氢混合气体的密闭容器中培养。辐照后30分钟、6小时和24小时分别收获辐照细胞。

放射协议：

放射中心产生的60Co-gamma射线被用作放射源。小鼠或细胞均以每分钟1Gy的速度接受辐照。在本研究中，动物实验使用了15Gy的致死剂量和10Gy的亚致死剂量，细胞实验使用了6Gy的致死剂量和亚致死剂量。

检测肠粘膜中的氢浓度：

使用氢气微电极检测生理盐水、培养基和肠道组织中的氢气浓度，该方法之前由Sun等人介绍过。