3.ZnPBA NCs的体外细胞抗氧化性能。

我们使用小鼠单核细胞RAW264.7和小鼠肺成纤维细胞MRC-5细胞系评估了ZnPBA NCs的体外细胞抗氧化特性。我们首先使用细胞计数试剂盒-8评估了ZnPBA NCs的体外生物相容性。将不同浓度（0、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/ml）的ZnPBA NCs与RAW264.7和MRC-5细胞共孵育12、24和48小时后，它们的活力均不受影响（图4a）。H2O2和tBHP是细胞内产生ROS的两种常用氧化剂。细菌的脂多糖（LPS）可被细胞的TLR受体识别，引发严重的免疫反应，诱导细胞内呼吸爆发产生大量ROS。

然后，我们使用H2O2、叔丁基过氧化氢（tBHP）和LPS来激发细胞的外源性和内源性氧化应激。与对照组和ZnPBA+H2O2组相比，光学显微镜图像显示，仅用H2O2处理MRC-5和RAW264.7细胞时，细胞上分别出现了明显的凋亡体和极化现象。经ROS诱导剂（250μM H2O2、350μM tBHP或100ng/ml LPS）处理的RAW264.7和MRC-5细胞系的存活率分别降至24.95%-44.25%和31.57%-40.81%。而与ZnPBA NCs共同孵育的细胞存活率相对较高，接近对照组。例如，在使用ZnPBA NCs（100μg/ml）对抗LPS抗原的情况下，RAW264.7和MRC-5的细胞活力分别提高到97.28±0.15%和95.17±3.80%，这表明ZnPBA NCs在对抗免疫系统在对抗LPS时产生的H2O2、tBHP等氧化物质方面具有很高的抗氧化性能（图4b和c）。

为了描述细胞内氧化应激的特征，我们采用了ROS反应荧光探针二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）来标记H2O2处理细胞诱导的细胞内ROS。共聚焦显微镜图像显示，经350μM H2O2处理的RAW264.7和MRC-5细胞发出强烈的绿色荧光，表明细胞内存在大量氧化应激。在与剂量为100μg/ml的ZnPBA NCs共同作用后，荧光大大减少（图4d）。

此外，我们使用AnnexinV-FITC/PI试剂盒评估了与H2O2和/或ZnPBA NCs共孵育后的RAW264.7和MRC-5细胞。与H2O2组明显的细胞凋亡信号（红色荧光）相比，ZnPBA NCs对氧化应激导致的细胞凋亡有很强的抑制作用，验证了ZnPBA NCs能有效缓解ROS诱导的氧化应激，防止细胞凋亡（图4e）。此外，还利用流式细胞仪对不同处理的DCFH-DA染色细胞进行了分析，以定量评估ZnPBA NCs消除氧化应激的性能。

经H2O2处理的RAW264.7细胞的ROS荧光强度平均从0.14±0.03%（未处理组）增至45.63±1.34%，表明细胞内存在相当强的氧化应激。然而，添加ZnPBA NCs能有效缓解这种应激，因为在添加50和100μg/ml ZnPBA NCs时，荧光强度分别降低到27.37±0.93%和11.2±0.24%，这进一步验证了ZnPBA NCs的细胞内氧化缓解性能（图4f）。用AnnexinV-FITC/PI染色的RAW264.7细胞的流式细胞术分析进一步表明了ZnPBA NCs在缓解氧化应激损伤和抑制细胞凋亡方面的能力。如图4g所示，与H2O2处理组相比，经50和100μg/ml ZnPBA NCs处理后，凋亡细胞水平分别从35.35±2.37%降至18.93±2.27%和9.97±1.09%，高度接近对照组6.37±0.26%的凋亡细胞水平。

为了弄清ZnPBA NCs如何减轻RAW264.7细胞的细胞内氧化应激，我们提取了mRNA含量，以评估抗氧化、炎症和细胞凋亡的转录表达。具体来说，在检测前，用PBS、H2O2（250μM）和H2O2（250μM）+ZnPBA NCs（100μg/ml）预处理RAW264.7细胞6小时。收获细胞并进行mRNA分析。与对照组相比，H2O2处理组的抗氧化相关mRNA（包括SOD1、SOD2、GPX4和CAT）分别上调了1.3、0.8、1.2和1.1倍，表明细胞内抗氧化机制被激活。然而，在ZnPBA NCs+H2O2组中，这些mRNA的相应细胞表达量大部分被下调，这可能与ZnPBA NCs的显著抗氧化作用有关（图4h）。

同样，与H2O2处理组相比，用ZnPBA NCs处理的细胞中NF-κB mRNA的表达也有所下降（图4i）。先前的研究表明，细胞内Zn2+的增加会促进A20的表达，A20是一种锌指蛋白，是TNFR和TLR激活NF-κB途径中的主要负调控因子。因此，细胞内Zn2+离子在炎症下调过程中发挥了重要作用，从而抑制了炎症性先天性和适应性免疫反应、细胞应激反应和细胞凋亡等。此外，氧化应激介导的损伤指标以及促进细胞凋亡的相关mRNA（如BAX、BAK1、APAF1和caspase-3）在H2O2组中上调，表明RAW264.7在H2O2刺激下的细胞凋亡途径。

然而，在H2O2之后使用ZnPBA NCs处理细胞（H2O2+ZnPBA NCs组），可以观察到这些mRNA的表达明显下调，具体证实了ZnPBA NCs可以有效缓解细胞的氧化应激，从而阻断细胞凋亡过程（图4j）。综上所述，ZnPBA NCs优异的体外生物相容性和ROS清除活性得到了验证，表明其在抗氧化/炎症基因调控中发挥着重要作用，在抗氧化催化的前沿领域具有广阔的生物医学应用前景。