摘要：

细菌性肺炎已被证实会导致急性和严重的病理性肺损伤，以及无法控制的氧化细胞因子风暴。针对细菌性肺炎的有效疗法要求高效清除病原体、缓解氧化应激和抗炎。然而，目前的疗法无法通过一种性能令人满意的单一药物来实现这些目标。在此，我们报告了一种自组装的普鲁士蓝类似物六氰基铁酸锌纳米催化剂（ZnPBA NCs），它具有出色的广谱抗菌活性，并对多种活性氧（ROS）和相关的细胞因子风暴具有抗氧化催化活性。通过使用各种氧化物质和体内小鼠细菌性肺炎模型，我们验证了合成的六氰合铁酸锌纳米催化剂可以同时消除细菌感染，并在很大程度上缓解感染引起的氧化应激和炎症，这表明它在防治多种细菌感染相关疾病方面具有广阔的临床应用前景。

引言：

炎症是先天性免疫系统面对病理刺激（如病原体、异常细胞和细菌/病毒）挑战时最普遍的一种反应，目的是清除有害物质以保护宿主。先天性免疫系统被激活后，免疫细胞分泌的细胞因子可特异性地增强病变部位血管系统的通透性，使白细胞（主要是巨噬细胞）穿越并聚集在目标部位。活化的巨噬细胞可通过吞噬和呼吸爆发清除外源性病原体和异常体细胞，引发炎症级联反应。当病理刺激恢复到生理水平时，巨噬细胞将失去活性，炎症消退。然而，如果病原体或其他病理刺激持续存在，炎症就会继续，导致免疫疲劳。例如，长期慢性炎症会使巨噬细胞钝化，在先天性免疫无法清除的残余病原体感染下，导致持续的炎症症状。在某些极端情况下，病原体入侵的恶化无法控制，会引发突出甚至致命的炎症，导致大量氧化呼吸爆发和细胞因子风暴，不可避免地对邻近组织造成副作用。细菌性肺炎是最危险的炎症类型之一，每年影响4.5亿人，造成约400万人死亡。要有效治疗细菌性肺炎，就需要清除病原体、抑制细胞因子风暴以及减少氧化物种等综合疗法。临床上，抗生素（如青霉素、氨苄西林和头孢菌素等）是治疗肺炎的首选药物，可杀死病原菌。然而,目前普遍存在的滥用抗生素的现象可能会导致产生抗菌素耐药性的风险，以及恶心、腹泻、头晕或头痛等副作用。此外，N-乙酰半胱氨酸和乙酰-L-肉碱等广谱抗氧化剂也被用于肺炎的治疗，但这些抗氧化剂的生物利用度差、效率低。此外，目前大多数治疗方法都侧重于抗生素或炎症抑制，导致炎症症状缓解缓慢或/和持续感染。因此，最有吸引力的药物应具有更高的生物利用度，更重要的是，同时具备抗细菌感染和抗氧化炎症的双重功能，以有效治疗肺炎，但这仍然是一个巨大的挑战。

具有多种催化性能和功能的纳米材料为解决细菌耐药性、清除ROS以及免疫调节等各种治疗难题提供了多种解决方案。例如，过渡金属基纳米催化剂、金属（Zn、Cu、Ce等）氧化物、多酚纳米颗粒已被广泛用于治疗炎症、细菌感染和氧化应激相关疾病。普鲁士蓝纳米粒子（PBNPs）是经美国FDA批准的重金属解毒剂，具有很高的生物相容性，在治疗老年痴呆症、动脉粥样硬化、胰腺炎等疾病方面被广泛研究。Zhang等人合成了多孔锰取代普鲁士蓝类似物（PBA），这是一类由其他金属取代原铁的普鲁士蓝类材料，包覆辛伐他汀后可清除ROS并缓解炎症，用于动脉粥样硬化治疗。在针对细菌性肺炎的治疗过程中，细胞因子风暴以及由此产生的氧化应激应得到特别的抑制，与此同时，我们认为细菌病原体的清除也同样重要。因此，基于PBA的新型纳米药物既能很好地抗氧化/抗炎，又能抗细菌感染，是非常理想的。

在本研究中，我们报告了一种双功能掺锌普鲁士蓝类似物纳米催化剂（ZnPBA NCs），通过同时抗菌和抗氧化/炎症，实现高效的细菌性肺炎治疗（图1）。研究人员详细考察了ZnPBA NCs的杀菌和抗氧化多酶类纳米催化性能。由于ZnPBA NCs具有良好的抗菌和抗炎特性，人工合成的ZnPBA NCs对细菌性肺炎具有广阔的治疗前景，并具有进一步的生物医学应用潜力，可用于治疗与炎症和氧化应激有关的疾病。

材料与方法：

材料：

氯化锌（ZnCl2）、铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐（TMB-HCl）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。盐酸（HCl，36.0%-38.0%）、过氧化氢（H2O2，30%）和叔丁基过氧化氢（tBHP）、脂多糖。磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4，0.01M）、汉克平衡盐溶液（HBSS，pH7.4，0.01M）、杜氏改良鹰培养基（DMEM，高糖）和青霉素-链霉素（10,000U/ml），胎牛血清（FBS）。所有化学品和试剂均为分析级，使用时无需进一步纯化。

表征：

用配备了EDS的Hitachi-HF5000拍摄了TEM图像。将样品分散在水中，然后滴在铜栅格上进行干燥。在Malvern Zetasizer Nanoseries上用DLS检测样品的Zeta电位和水动力粒度分布。ZnPBA NCs的晶体结构由X射线衍射仪在40kV和40mA下用CuKα辐射分析，扫描速率为每步2秒，步长为0.02。ZnPBA NCs的拉曼光谱在LabRAM HR Evolution上记录，激光波长为1500至3400cm。样品通过冷冻干燥法制备。傅立叶红外光谱仪NicoletiS10光谱仪使用KBr小球对ZnPBA NCs进行表征。X射线光电子能谱仪在ESCAlab250上运行。样品在2kV1μA下进行了表面蚀刻预处理。数据由CasaXPS软件进行分析。

ZnPBA NCs的合成：

将0.5mmolK3[Fe(CN)6]溶于50mlHCl（溶液A）。0.75mmolZnCl2和200mgPVP溶于50mlHCl（溶液B）。然后，在搅拌下以120毫升/小时的速度将溶液A注入溶液B。首先进行纯化以去除未反应的物质。使用超滤管进一步浓缩所得溶液。钾、铁和锌的浓度通过ICP-OES进行定量。

ROS清除活性：

采用TMB发色法评估ZnPBA NCs的-OH清除活性。将250μMTMB、1mMFeSO4和ZnPBA NCs（1、2、5、10、20、40、80和160μg/ml）加入HAc/NaAc缓冲溶液（0.05M，pH=4.5）中。然后在上述溶液中加入2mMH2O2，在黑暗中孵育5分钟。用微孔板阅读器检测光吸收。

ZnPBA NCs的超氧阴离子清除活性采用WST-8总超氧化物歧化酶检测试剂盒进行检测。根据生产商的说明，在工作液中分别加入0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50和100μg/ml的ZnPBA NCs。孵育30分钟（37◦C）后测量光吸收。根据试剂盒提供的公式计算ZnPBA NCs的抑制率。

ZnPBA NCs的EPR光谱在BrukerE500上进行。选择5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作为捕氮剂，以捕获羟自由基和超氧阴离子。在检测羟自由基时，在PBS缓冲液中加入2.5mMH2O2、20μMFeSO4、100mMDMPO和100μg/mlZnPBA NCs。检测超氧阴离子时，在PBS缓冲液（0.1M，pH=7.4）中加入0.1单位/毫升黄嘌呤氧化酶、1mM黄嘌呤、100mMDMPO和100μg/mlZnPBA NCs。然后将等量溶液转移到石英管中进行EPR测量。

ZnPBA NCs的H2O2清除活性是通过Unisense氧微电极检测溶解氧来实现的。具体来说，将氧微电极插入含有10mMH2O2和0、25、50和100μg/ml ZnPBA NCs的溶液中。在15分钟内记录校准溶解氧浓度。

通过使用氧微电极（Unisense）测量溶解氧来测定ZnPBA NCs的催化稳定性。溶液的温度（20、25、30、35、40、45和50◦C）由水浴控制，溶液的pH值（4.0、5.5、6.5、7.4、8.0和10）由不同pH值的柠檬酸钠-盐酸缓冲体系调节。将氧微电极垂直插入含有5mMH2O2或5mMH2O2+10μg/mlZnPBA NCs的缓冲溶液中。在5分钟内记录校准溶解氧浓度。

细胞培养：

小鼠白血病单核/巨噬细胞系和人肺成纤维细胞医学研究理事会细胞株5（MRC-5）购自中国科学院类型培养物保藏委员会细胞库。RAW264.7和MRC-5细胞在含有10%FBS和100U/ml青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中培养，培养箱温度为37◦C，5%CO2加湿。

ZnPBA NCs的体外生物相容性评估：

细胞计数试剂盒-8用于ZnPBA NCs的体外生物相容性检测。具体方法是将RAW264.7细胞以每孔1×104的密度接种到96孔板中，培养12小时后弃去培养基，用PBS冲洗细胞两次。随后，将含有不同浓度ZnPBA NCs（0、3.125、6.5、12.5、25、50和100μg/ml）的新鲜DMEM高葡萄糖培养基接种到孔中。在孵育12小时、24小时和48小时后，用PBS冲洗细胞两次，然后加入100μl新鲜DMEM高糖培养基（10%CCK-8溶液，不含FBS），孵育1小时。细胞活力（对照组的百分比）按以下公式计算。

其中，Asample是有ZnPBA NCs共孵育孔的吸光度，Acontrol是没有ZnPBA NCs共孵育孔的吸光度，Ablank是没有细胞的孔的吸光度。