TLR4激活被发现参与高葡萄糖诱导的系膜细胞过度增殖

蛋白质印迹显示，高葡萄糖（25 mM）孵育显著激活了TLR4的表达（图1D）。通过siRNA下调TLR4可以逆转小鼠系膜细胞的过度增殖（图2C）。有趣的是，敲低CSE也显著增加了小鼠系膜细胞中的TLR4表达（图2B）；NaHS处理可以显著抑制TLR4激活并抑制细胞过度增殖（图2B）。此外，TLR4下调并未显著改变高葡萄糖诱导的CSE表达抑制（图2A）。然而，TLR4沉默可以显著消除由CSE下调引起的细胞过度增殖。这些结果暗示在由高血糖诱导的系膜细胞过度增殖通路中，TLR4可能位于CSE通路的下游。

图2. CSE抑制诱导的TLR4激活可能参与HG导致的系膜细胞过度增殖

(A) TLR4抑制未改变高葡萄糖处理的小鼠系膜细胞中CSE的表达（数值为均值±标准误；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+对照siRNA；n = 4）。

(B) CSE抑制导致TLR4激活，而NaHS处理可逆转这一现象（数值为均值±标准误；*P < 0.05 vs. 对照siRNA；#P < 0.05 vs. CSE siRNA；n = 4）。

(C) TLR4沉默显著逆转HG诱导的细胞过度增殖（数值为均值±标准误；P < 0.05，*P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+对照siRNA；##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖+对照siRNA；n = 4）。

(D) TLR4抑制显著抑制CSE沉默诱导的系膜细胞过度增殖（数值为均值±标准误；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+对照siRNA，##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖+对照siRNA；n = 4）。

我们接着研究了TLR4对系膜细胞中PI3K-Akt通路的影响。蛋白质印迹分析显示，高血糖显著增强了PI3K和Akt的磷酸化，在TLR4敲低后恢复到正常水平，尽管PI3K和Akt的总表达保持不变（图3A和B）。如图3C所示，通过LY294002抑制PI3K也显著减轻了高葡萄糖诱导的细胞增殖。

图3. PI3K通路抑制以TLR4依赖性方式显著抑制HG诱导的系膜细胞增殖

(A, B) HG导致小鼠系膜细胞PI3K/Akt表达显著增加，而TLR4沉默可下调这一表达（数值为均值±标准误；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+对照siRNA，##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖+对照siRNA；n = 4）。

(C) PI3K抑制显著抑制HG处理诱导的系膜细胞过度增殖（数值为均值±标准误；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖；n = 4）。

下调TLR4抑制PI3K-Akt通路并抑制小鼠系膜细胞过度增殖

讨论

本文的主要发现是，糖尿病肾损伤可能是由硫化氢的下调诱导的，这种下调依赖于TLR4表达增强和H₂S合成减少。此外，TLR4介导的PI3K-Akt通路激活部分促进了糖尿病肾病的病理生理。

几个世纪以来，硫化氢（H₂S）一直被认为具有高度毒性。然而，最近H₂S已被认为是介导广泛生理效应的物质。一氧化氮（NO）是一种具有生物学和调节特性且半衰期很短（几秒）的气体，其特性与H₂S相似。与NO一样，H₂S的合成和生物利用度对生理和病理生理过程至关重要。H₂S是一种高亲脂性分子，能够通过扩散自由穿透所有类型细胞的膜，不需要专门的膜转运蛋白。通过其存在和酶促产生，H₂S作为重要的气体递质，如一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO），因其信号传导能力而受到关注。

越来越多的证据表明，H₂S的上调对糖尿病引起的损伤（如心脏纤维化、肾小球足细胞损伤、伤口愈合障碍等）发挥保护作用。此外，硫化氢（H₂S）的减少被认为在糖尿病血管并发症（包括糖尿病肾病）中起关键作用。研究表明，较低的H₂S浓度是糖尿病肾病发生和发展的原因。在伴有肾病的2型糖尿病中，H₂S生成与CSE/CBS mRNA表达呈负相关。糖尿病相关肾病中存在紊乱的H₂S代谢。此外，据报道H₂S对认知疾病具有神经保护作用。H₂S保护作用的潜在机制涉及氧化应激和自噬。

糖尿病肾病是世界范围内终末期肾病的主要原因。显著的系膜基质扩张是糖尿病患者肾脏病变的特征。不仅是系膜细胞，上调的硫化氢也能减轻高葡萄糖诱导的小鼠足细胞（MPC）损伤。然而，H₂S发挥其多种作用的确切机制和通路尚未完全阐明。我们的研究结果表明，通过添加外源性供体（NaHS）或过表达CSE/CBS，上调H₂S可以抑制小鼠系膜细胞的过度增殖。

TLR是病原体相关分子模式（PAMPs）受体家族之一，是具有胞质尾部的完整膜糖蛋白，在病原微生物的早期识别和宿主防御中发挥作用。TLR-4也识别其他配体。与其他TLR一样，TLR-4能够识别内毒素（LPS）和微生物分子（糖脂、呼吸道合胞病毒融合蛋白和热休克蛋白）以及内源性损伤诱导的组织分子，从而产生细胞内信号响应。值得注意的是，高血糖被证明可诱导TLR4表达。Pahwa等人发现TLR4介导高血糖诱导的大血管主动脉内皮细胞炎症和内皮糖萼的扰动。高血糖也能在糖尿病视网膜病变的内皮细胞中诱导并激活TLR4。本研究证明TLR4敲低抑制了由高血糖诱导的系膜细胞异常增殖，这与其他人的报道一致。

有趣的是，TLR4被报道与H₂S合成和生物利用度相关。Tamizhselvi等人报道H₂S可能通过P物质上调TLR4通路。与此一致，我们的体外实验表明，下调H₂S能显著激活小鼠系膜细胞中的TLR4表达。反之，据报道在大鼠中TLR4通过NF-κB激活上调CBS表达。Zheng等人发现，与野生型小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠显示出H₂S合成酶CSE的表达升高，从而消除了脂多糖的炎症效应。

磷酸肌醇-4,5-二磷酸3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路在糖尿病中被抑制。我们的结果表明，干扰TLR4抑制了PI3K/Akt通路，减轻了异常的系膜细胞增殖。本研究证明H₂S对高血糖诱导的系膜细胞增殖的保护作用可能与下调PI3K/Akt信号通路有关。更多证据表明PI3K/Akt信号通路参与了H₂S的生理效应。

总之，我们发现HG抑制内源性H₂S合成并诱导小鼠系膜细胞过度增殖；TLR4激活参与HG诱导的系膜细胞过度增殖；下调TLR4抑制PI3K-Akt通路并抑制小鼠系膜细胞过度增殖。结论是，高葡萄糖可以通过TLR4依赖性方式抑制硫化氢合成诱导小鼠系膜细胞过度增殖。