材料与方法

细胞培养和处理

小鼠系膜细胞（购自上海中国科学院）根据制造商的说明，在补充有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中，于37°C，CO₂培养箱中培养。将密度为1 x 10⁵/mL的细胞接种在6孔板中，使其达到80-90%汇合度。使用含0.03%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞。正常葡萄糖组用5.5mM葡萄糖处理，而高葡萄糖组分别用25 mM、30 mM、35 mM和40 mM葡萄糖处理。过夜饥饿后，细胞与正常或高葡萄糖一起孵育24小时。NaHS（Sigma）在加入葡萄糖的同时加入系膜细胞，浓度分别为5μM、10μM、30μM、50μM和100μM。系膜细胞的增殖通过MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物，Sigma Aldrich）法检测，如前所述。

RNA干扰和PI3K抑制

针对TLR4的小干扰RNA购自Santa Cruz（sc-40261）。使用siPORT NeoFx转染试剂（Ambion）将siRNA转染至小鼠系膜细胞，根据制造商的说明进行操作。LY294002，（2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮）被用作磷脂酰肌醇3-激酶的特异性抑制剂。

实时H2S生成测定

H₂S生成的实时测定如前所述。简言之，将细胞收集在含有蛋白酶抑制剂（2 mM苯甲基磺酰氟，1 mM原钒酸钠和10 mg/ml抑肽酶）的PBS中，并在冰上匀浆15秒。然后将悬液在5000 rpm离心5分钟，之后将上清液置于温度控制的微呼吸室（Unisense）中，使用微型H₂S微呼吸传感器（Model H2S-MRCh;Unisense）和Unisense PA2000放大器测量H₂S生成。H₂S生成通过改良的Bradford法测定总蛋白浓度进行标准化。

蛋白质印迹分析

蛋白质印迹分析如前所述进行。小鼠系膜细胞用冰冷的RIPA裂解缓冲液（P0013C,Beyotime）进行匀浆和裂解。每孔上样30μg蛋白质于10%SDS-PAGE凝胶中，然后转移到硝酸纤维素膜上。用溶解在PBS中的5%脱脂奶粉封闭后，将膜与一抗在4°C下以1:1000稀释度孵育过夜。实验中使用的抗体有：TLR4(25)(Santa Cruz,sc-293072),CSE(CTH P-15)(Santa Cruz,sc-131905),磷酸化-Akt(Ser473,Santa Cruz,sc-293125),Akt(Santa Cruz,sc-5298),磷酸化-PI3K(Santa Cruz,sc-130211)和PI 3-激酶C2α抗体(H-300,Santa Cruz,sc-67306)。将辣根过氧化物酶偶联的二抗应用于膜上，在室温下孵育1小时。使用增强化学发光蛋白质印迹检测系统（Santa Cruz）可视化免疫反应蛋白。采用GeneGnome HR扫描仪通过GeneTools软件对膜的印迹进行定量。测定肌动蛋白（Actin）表达以量化相对蛋白表达水平。

统计分析

数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。仅两组间比较时采用双尾Student's t检验，多于两组间比较时采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Student-Newman-Keuls事后检验。使用SPSS 16.0（SPSS,Inc.），小于0.05的P值被认为具有统计学意义。

结果

高葡萄糖抑制内源性H2S合成并诱导小鼠系膜细胞过度增殖

首先，我们研究了葡萄糖对在5mM（对照）、20 mM、25 mM和30 mM葡萄糖中培养的小鼠系膜细胞活力的影响。结果发现，高葡萄糖孵育导致小鼠肾系膜细胞显著过度增殖，呈浓度依赖性（图1A）。25 mM葡萄糖诱导了细胞活力的高度增加。然后评估了在高葡萄糖培养的小鼠系膜细胞中的内源性H₂S合成。蛋白质印迹分析检测到，与对照组相比，20 mM、25 mM和30 mM葡萄糖组中CSE表达显著降低（图1C）。此外，与对照组相比，在25 mM和30 mM葡萄糖中孵育的细胞的H₂S生成速率显著降低（图1B）。最后，通过施用NaHS进行H₂S补充。结果发现，NaHS处理显著抑制了系膜细胞的过度增殖。

图1. 高葡萄糖（HG）诱导小鼠系膜细胞显著过度增殖，这可能部分归因于内源性H₂S合成缺陷或TLR4激活。（A）HG诱导小鼠系膜细胞显著过度增殖。25 mM甘露醇处理未显著改变小鼠系膜细胞活力（数值为均值±标准误；P < 0.05，P < 0.01 vs. 5mM葡萄糖；##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖；n = 4）。（B）与5 mM葡萄糖相比，25 mM和30 mM HG处理显著降低H₂S生成速率（数值为均值±标准误；P < 0.05，P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；n = 4）。（C）HG处理以浓度非依赖性方式显著降低CSE表达（数值为均值±标准误；P < 0.05，P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；n = 4）。（D）25mM和30mM HG处理显著增加TLR4表达（数值为均值±标准误；P < 0.05，**P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；n = 4）。