3.草氨酸对正常和高血糖NRK-52E培养细胞呼吸的影响

图3：经100mM草氨酸处理或未经100mM草氨酸处理的对照细胞和高血糖细胞培养物的呼吸参数。对基础呼吸、ATP链接呼吸、泄漏呼吸和最大呼吸进行了测定。单用高血糖条件和草氨酸处理对所有测量参数的影响都是递减的，而在高血糖条件下用草氨酸处理细胞可显著增加所有呼吸参数（p<0.0001）。

为了评估在高血糖培养中诱导的新陈代谢以及草氨酸处理后无氧代谢的减少是否与NRK-52E细胞耗氧量的变化有关：测量了基础呼吸、ATP链接呼吸、泄漏呼吸和最大呼吸。高血糖条件下的NRK-52E细胞和草酸盐处理本身都不会对呼吸参数产生影响。而高血糖条件和草氨酸处理的结合则显著增加了所有呼吸参数（p<0.0001）（图3）。

4.草氨酸对正常和高血糖NRK-52E培养细胞中mRNA表达的影响

图4：控制和未处理草氨酸的高血糖细胞培养物中LDH、PDH、SDH、HO-1和VEGF的mRNA表达。虽然LDH、PDH和SDH的表达有所升高，但未达到显著水平。草氨酸可明显提高两组中血管内皮生长因子的表达。HO-1的表达也有类似趋势，但未达到显著水平。

为了了解代谢和呼吸的变化是如何发生的，我们检测了关键酶的mRNA表达水平，发现LDH、丙酮酸脱氢酶（PDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）的表达几乎不受高血糖培养条件的影响。另一方面，草氨酸处理会增加正常和高血糖NRK-52E细胞培养物中所有基因的表达，但并不显著（图4A-C）。在正常和高血糖的NRK-52E细胞中，草酸盐处理和未处理的NRK-52E细胞中血管内皮生长因子的表达均有明显变化（p=0.0004）（图4D），血红素氧合酶-1（HO-1）标记物的表达也有同样的趋势（图4E）。

讨论：

本研究的主要发现是，在高血糖条件下，NRK-52E细胞经草氨酸处理后，新陈代谢完全改道。这似乎导致了基础和最大呼吸能力的提高以及乳酸生成的减少。乳酸盐的产生与氧化还原平衡密切相关，即与细胞膜NAD+/NADH平衡密切相关。有趣的是，乳酸盐生成量的主要变化受高血糖条件的影响，而氧化还原平衡（NAD+/NADH比率）、细胞活力和增殖则受草酸盐处理的影响。这表明乳酸脱氢酶LDH抑制确实会导致NAD+/NADH比率发生巨大变化，进而引导NRK-52E细胞增加氧化磷酸化（图5）。这些发现与高度糖酵解细胞的报告一致，在高度糖酵解细胞中，草氨酸已被证明能将糖酵解通量转向氧化磷酸化，即把沃伯格代谢表型（即使在有足够氧气维持氧化磷酸化的情况下，乳酸盐的产生也会增加）转变为巴斯德代谢表型。

有趣的是，最近的研究结果表明，糖尿病小鼠代谢通量的增加具有保护肾脏的作用，特别是与PKM2激活有关。

此外，我们的研究表明，LDH抑制可能是提高近端肾小管细胞氧化能力的一个新的治疗靶点。但值得注意的是，在高血糖NRK-52E中进行草氨酸处理会显著降低细胞的生长和增殖。

在一些癌细胞系中，草氨酸被证明能以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡，而其他癌细胞系对细胞凋亡的诱导作用则微乎其微，有鉴于此，我们使用了相对高浓度的草氨酸，在分析时所有细胞培养物的存活率都超过了50%。细胞生长和增殖的减少可能是诱导细胞凋亡的结合，以及草酸盐将糖酵解通量重新定向到有氧途径并进一步降低NAD+量的事实，如测量的NAD+/NADH比率所示。之前对糖尿病大鼠和患者的研究报告支持将高血糖驱动的假缺氧与缺氧条件下的预后恶化联系起来，这同样加剧了NAD+的缺乏。

在正常和高血糖条件下的NRK-52E中，草氨酸处理可诱导平行和相似的细胞形态和增殖变化，这可能源于NAD+/NADH比值的改变，损害了代谢通量，最终导致细胞活力丧失。细胞质NAD+的消耗高达50%，这与细胞新陈代谢和活力的类似紊乱有关。

NRK-52E细胞中与高血糖条件相关的假缺氧表型本身并不会激活细胞的缺氧反应，如血管内皮生长因子（VEGF）的表达，它受缺氧诱导因子（HIF）的调节，而缺氧与HIF激活后VEGF表达的增加有关。这共同表明，草氨酸能重新激活血管内皮生长因子对氧的依赖性敏感性，而这种敏感性之前已在高血糖培养条件下丧失，因此产生了一种类似于缺氧表型的表型。有趣的是，其他与HIF相关的酶，如SDH和HO-1没有或几乎没有反应。原因可能是与最近报道的保护性HIF激活不同，HO-1和血管内皮生长因子在HIF激活后都增加了，从而改善了糖尿病大鼠的肾脏预后。LDH和/或PDH的表达不太可能驱动糖酵解表型，因为LDH的抑制与乳酸产生的变化有关。

乳酸是葡萄糖生成的主要底物，因此以往的研究能够描述与抑制肝脏和肾脏葡萄糖生成相关的NADH:NAD+比率的变化。营养水平会调节丙酮酸羧化酶（PC）的活性（PC是糖元生成的第一步），因此饥饿会导致PC活性升高。草酸盐的脱靶效应包括PC，通过非竞争性和非竞争性抑制。有趣的是，在非饥饿条件下，只看到极少的非加速PC活性，因此PC受抑制不太可能是我们的研究中出现的表型的主要原因，但在PC活跃的情况下，这仍然是一个未决问题，因此需要进一步的研究来回答这个问题。

我们的研究结果表明，在高血糖条件下培养的NRK-52E细胞可通过抑制乳酸脱氢酶LDH增加有氧糖酵解。这就抵消了高血糖培养条件下诱导的代偿性无氧糖酵解。这种新陈代谢重编程的潜在机制可能来自于与HIF通路相关的氧化还原平衡和新陈代谢适应的改变，从而消除了NRK-52E细胞中高血糖条件的HIF抑制特性。这些发现支持了进一步研究新型LDH抑制剂以防治糖尿病相关肾病的必要性。