超极化实验：

使用SPINLAB极化器进行超极化实验。将100μ[1-13C]（含有15mM的三苯甲基自由基）放入偏振器中。溶液在193.93GHz频率下被极化三次（2小时）。将超极化样品溶解在17.5毫升溶解缓冲液（100毫克/升EDTA）中，并在1.46毫升中和缓冲液（0.4M TRIS，100毫克/升EDTA，0.72M NaOH）中和，得到生理pH值为61.4-68.4毫摩尔的等渗[1-13C]丙酮酸。溶解后的样品温度为30-35°C。在4.5毫升呼吸培养基中稀释0.5毫升[1-13C]丙酮酸，最终浓度约为6毫摩尔[1-13C]丙酮酸。超极化实验在台式1T NMR系统中进行，以10°翻转角和2秒重复时间进行180次采集。使用iNMR软件对数据进行了比率分析，与之前报道的方法相同。

LDH活性测定：

LDH活性测定按照生产商的说明进行，仅做少量改动。在室温（RT）下用哺乳动物蛋白提取试剂m-per裂解1×106个细胞，并补充蛋白酶抑制剂醇15分钟，然后离心并收集上清液。在PHERAstar FS微孔板阅读器中对384孔板进行分析。在吸光度光谱的最高峰（462nm）处读取吸光度，并根据LDH样品溶液中的蛋白质量对活性测量值进行归一化处理。蛋白质定量使用Qubit3.0Flourometer进行测量。

NAD+/NADH定量：

利用酶循环反应测定法对细胞内核苷酸、NAD和NADH及其比率进行定量。用哺乳动物蛋白提取试剂mper和蛋白酶抑制剂醇和NADH的定量根据生产商的说明分析在PHERAstar FS微孔板阅读器的384孔板中进行。

RNA纯化和定量PCR：

将1×106个细胞/毫升接种到6孔板中，在37°C、湿度为5%CO2的培养箱中培养过夜。处理后，使用TRIZOL提取RNA。使用Qubit3.0Flourometer确认RNA的浓度和纯度。CDNA合成使用Revert Aid First strand cDNA合成试剂盒。根据制造商的说明使用SYBR Green qPCR Master Mix进行QPCR。简言之，以100ngcDNA为模板进行PCR扩增，通过熔解曲线分析确认产物的特异性。实时qPCR在Agilent Ariamx实时系统上进行。表1列出了用于qPCR的引物。

统计分析：

所有数据均以平均值±SEM表示。所有统计分析均在GraphPad Prism5中进行。数据分析采用非配对学生t检验和双向或三向重复测量方差分析。当数据不呈正态分布时，执行对数变换。P<0.05（*）的值被认为具有统计学意义。

结果：

1.草氨酸对正常和高血糖NRK-52E培养细胞活力、增殖和表型的影响

图1：草氨酸对正常和高血糖细胞培养物中细胞活力、增殖、表型和乳酸生成的影响。A)在高血糖培养条件下（p=0.8933）以及草氨酸处理后（p=0.0002），细胞活力下降。B)细胞增殖在高血糖条件下增强（p=0.8429），但在草氨酸处理后受到抑制（p<0.0001）。C)四种细胞培养物的代表性图像显示草氨酸处理后表型的变化。D)在正常和高血糖条件下，NRK-52E细胞培养物中13C乳酸-Σ信号的变化与草氨酸处理有关。高血糖细胞培养条件增加了信号（p=0.0005），而草酸盐处理降低了信号（p=0.0366）。

为了确定高血糖时抑制近端肾小管细胞（PTC）LDH的效果，我们在正常培养条件和高血糖培养条件下培养了NRK-52E细胞。两种培养条件均使用LDH抑制剂草氨酸进行处理。我们检测了细胞的存活率和增殖率，发现当培养细胞暴露在高血糖条件下时，存活率略有下降，增殖率微弱上升（图1A和B）。然而，在正常和高血糖的NRK-52E细胞培养物中加入草氨酸会显著降低细胞活力，分别从90.76%和88.86%降至79.10%和81.64%（p=0.0002），增殖也分别从3.5×106和3.94×106降至2.43×106和2.17×106（p<0.0001）。草氨酸处理对细胞形态也有深远影响，因为处理后细胞体积增大（图1C）。单独暴露于高血糖条件下的细胞的细胞质和细胞核形态似乎与对照细胞相似。单独暴露于草氨酸会导致细胞体积增大，细胞质出现中度空泡化。高血糖条件和草酸盐处理相结合，细胞体积和胞质空泡化程度略有增加。

2.草氨酸对正常和高血糖NRK-52E培养细胞中LDH、乳酸生成和NAD+/NADH比率的影响

图2：LDH活性和NAD+/NADH总定量。在高血糖条件下培养的NRK-52E细胞中，无论是否经草铵膦处理，LDH的检测值都较高（p=0.2551）。高血糖条件下（p=0.3181）和草铵膦处理后（p=0.0568），NAD+/NADH比值均下降。

使用超极化[1-13C]丙酮酸，发现在葡萄糖上培养24小时的NRK-52E细胞的乳酸信号比正常对照细胞增加了3倍（p=0.0005）（图1D）。用草酸盐处理正常和高血糖细胞培养物表明，用草酸盐处理减少了两组细胞中丙酮酸到乳酸的产生（p=0.037）（图1D）。与正常细胞相比，高血糖条件下NRK-52E细胞的LDH活性在数值上更高，尽管没有达到统计学意义（p=0.0572），同样，草氨酸处理后LDH活性在数值上更低（p=0.098）（图2A）。正常细胞和高血糖细胞的NAD+/NADH比值基本相似（p=0.3181），而在草氨酸处理后观察到NAD+/NADH比值降低（p=0.0568）（图2B）。