摘要:

糖尿病肾病（DKD）与代谢模式的改变有关，即使在氧气供应充足的情况下，也会导致乳酸生成增加。研究表明，高血糖是决定DKD发展的一个重要因素。在此，我们探讨了在高血糖条件下，乳酸脱氢酶（LDH）抑制剂草酸盐对离体大鼠肾近曲小管细胞（NRK-52E）产生的代谢影响。在1T NMR系统中，用超极化[1-13C]丙酮酸在高D-葡萄糖（25mM）负荷下或不在高D-葡萄糖（25mM）负荷下对草氨酸（100mM）处理24小时的细胞进行了研究。使用氧气微电极系统进行了呼吸测量。在存在或不存在高D-葡萄糖的情况下，对细胞进行草氨酸处理可分别减少乳酸产生/积累36.5%或22.5%。研究发现，NRK-52E细胞的增殖减少、肥大效应以及血管内皮生长因子（VEGF）表达升高。在用草氨酸处理高D-葡萄糖培养的NRK-52E细胞时，糖酵解通量的增加导致细胞耗氧率的上调。我们的研究结果表明，暴露于高血糖条件下的体外培养NRK-52E细胞可通过抑制LDH使糖酵解通量转向氧化磷酸化。有氧代谢和无氧代谢之间的这种联系可能取决于氧化还原平衡（NAD+/NADH比率）。总之，高血糖条件和草酸盐处理会改变NRK-52E细胞的代谢表型，使其在NAD+/NADH比值降低的介导下增加氧的利用，进而降低细胞的增殖/存活率。

引言：

糖尿病（DM）是慢性肾病（CKD）和终末期肾病（ERSD）的主要病因。越来越多的证据表明，肾小管间质空间的变化是导致DKD的主要决定因素。近端肾小管占外肾皮质的90%，约占整个肾脏质量的50%。在DKD的发展过程中，肾脏在葡萄糖稳态中的关键作用非常重要，其中包括葡萄糖生成、葡萄糖滤过、葡萄糖重吸收和葡萄糖消耗过程。众所周知，糖酵解和氧化磷酸化等ATP生成途径在细胞生命周期中举足轻重，因此也是包括DKD在内的肾脏疾病进展的关键组成部分。有趣的是，新的报告显示，激活丙酮酸激酶M2（PKM2）可增加糖酵解通量，从而在糖尿病啮齿动物模型中产生肾保护作用。然而，人们对与高血糖相关的糖酵解适应性及其对糖尿病肾脏病理生理学中细胞模式改变的贡献仍然知之甚少。高血糖的后果不仅会改变糖酵解通量，还会改变耗氧量，从而导致缺氧。缺氧是DKD发生和发展的早期事件，而占肾耗氧量80%的近端肾小管尤其容易缺氧。

缺氧不可避免地会增加乳酸的产生，但却牺牲了对能量更有利的氧化磷酸化。另一方面，已证明高血糖会诱发一种变异的缺氧，即假性缺氧。高血糖会导致多元醇通路通量增加；高级糖化终产物（AGE）形成增加；蛋白激酶C（PKC）同工酶活化；和己二胺通路通量增加--最终导致NADH/NAD+比率升高和乳酸盐产生。在此，我们推测，如果LDH表达或乳酸盐生成的增加在高葡萄糖诱导的近端小管细胞代谢重编程中起着关键作用。那么是否有可能使用LDH抑制剂草氨酸直接靶向LDH酶？

草氨酸是丙酮酸的同种异构电子类似物，也是一种著名的LDH抑制剂。由于草氨酸在肿瘤细胞的沃伯格效应中起到阻碍LDH-M的作用，长期以来一直备受研究关注，最近又被证实能改善糖尿病小鼠的胰岛素敏感性。1H和/或13C NMR光谱法可量化稳态代谢物浓度，但受灵敏度限制，扫描实验时间较长，且难以转化为体内条件。超极化13C NMR是一种补充技术，能以足够的灵敏度评估代谢通量，甚至能绘制体内快速代谢过程图，从而将该方法直接应用于体内情况。为了研究草酸盐补充剂对高血糖和LDH抑制的影响，我们在此使用了超极化[1-13C]丙酮酸NMR光谱和呼吸测定法。

材料与方法：

细胞培养：

NRK-52E细胞是一种大鼠肾上皮细胞系，NRK-52E细胞在含低糖的Dulbeccos改良老鹰培养基，该培养基补充有10%的胎牛血清、10单位/毫升青霉素和10毫克/毫升链霉素。细胞数量和活力通过胰蓝排除试验测定。每隔两天或三天更换一次生长培养基，并对细胞进行亚培养，直到菌落汇合度达到80%时再做进一步测定。在所有细胞实验中，共准备了四组细胞，一组未经处理，一组用25mM D-葡萄糖处理24小时，一组用100mM草氨酸处理24小时，一组用25mM D-葡萄糖和-100mM草氨酸处理24小时。

呼吸测定法：

37°C下，在带有O2电极的封闭式Unisense微呼吸室（UnisenseA/S，丹麦奥胡斯）中测量耗氧量。每次实验使用1000万个悬浮的NRK-52E细胞。在进行微呼吸测量前，用镊子夹取NRK-52E细胞并在DMEM缓冲液中重悬。测量开始前，将细胞转移到密闭室并让其稳定5分钟。在5µM Oligomycin的存在下抑制ATP合酶。最大呼吸能力是在解偶联剂间氯苯基甲酰氰腙（CCCP）滴定步骤的存在下测量的。加入罗替酮（1µM）和抗霉素A（5µM）以完全关闭氧化磷酸化。由此产生的呼吸作用来自非半胱氨酸氧消耗过程。